大孔吸附树脂纯化万古霉素发酵液的研究.docx

3大孔吸附树脂纯化万古霉素发酵液的研究一1,杜连祥1,马书章1,张颖23张(11天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室,天津300457;21天津市土壤肥料工作站,天津300061)摘要研究6种大孔吸附树脂对万古霉素的静态吸附与解吸性能,从中选出最适树脂进行动态吸附实验,研究上样液浓度、pH值、上样体积流量对树脂动态吸附量的影响及洗脱过程。结果:选择XAD-16树脂进行动态吸附实验。适合的上样液浓度、上样液pH值、上样液体积流量分别为2109mg/ml,910和215ml/min。以10%乙醇/011%盐酸/水为洗脱剂,以115ml/min的流速进行洗脱即可基本将万古霉素从树脂上解吸下来。结论:万古霉素发酵液经XAD-16树脂吸附洗脱后,洗脱液中万古霉素高效液相色谱峰面积百分比可达85161%。关键词万古霉素;XAD-16树脂;吸附;解吸中图分类号:Q517;R97714文献标识码:A文章编号:1005-8915(2007)02-0127-04万古霉素是从东方拟无枝酸菌(Amycolatop2sisorientalis)的发酵液中分离得到的具有抗革兰氏阳性菌作用的一种糖肽类抗生素,是治疗由金黄色葡萄球菌引起的严重感染的首选药物,常常作为在β-内酰胺类抗生素或其它抗菌药物治疗失败后可以使用的最后手段,临床上多使用其盐酸盐。万古霉素的分离纯化有树脂吸附分离法[1]、沉淀法[2]、色谱制备法[3]、亲和吸附法[4]、双水相萃取法[5]、反胶团萃取法[6]等,也有将其中几种方法综合使用的[7]。色谱制备法、亲和吸附法成本较高,双水相萃取法、反胶团萃取法影响因素较复杂,提取率不高。陈代杰[1]等用D1300树脂对万古霉素的分离纯化进行研究,得到的万古霉素洗脱液质量较好,其万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的75%以上。将洗脱液进一步脱盐脱色,得到万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的75%以上,浓度不低于80mg/ml的浓缩液。本研究选用了6种大孔吸附树脂对万古霉素发酵液进行吸附解吸实验,从中选出了较适合的树脂,并进一步研究了其操作条件,为万古霉素的生产提供了相关参考依据。标准品,Sigma公司;XAD-16树脂(极性大孔吸附树脂,树脂结构:聚苯乙烯—二乙烯苯,比表面积:800m2/g,平均孔径:15nm,平均粒径:017mm),上海罗门哈斯化工有限公司;NKA-Ⅱ、NKA-9、S-8树脂,南开大学化工厂;AB-8、NKC-9,天津市光复精细化工研究所;甲醇(色谱纯)、三乙胺、乙腈、四氢呋喃、磷酸、硫酸、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇(均为分析纯),天津市元立化工有限公司。112主要仪器JA21002型电子天平,上海精天电子仪器有限公司;pHS-3CW微机型酸度计,上海理达仪器厂;SHB-B95型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;SSI-PC2000型高效液相色谱仪,天津兰博实验仪器设备有限公司。C18BDS5μ416mm×250mm色谱柱,菲罗门(天津)科技发展有限公司;玻璃树脂柱(117cm×30cm);DHL-A电脑恒流泵,上海沪西分析仪器厂;DBS-100电脑全自动部份收集器,上海沪西分析仪器厂。113实验方法11311万古霉素发酵液预处理万古霉素发酵液凝聚处理:将发酵液pH值调至410,加入偏铝酸钠,用量为750mg/L,搅拌6min后,静置,待分层后抽滤发酵液,滤液备用。11312大孔吸附树脂预处理预处理在树脂柱上1材料与方法111材料与试剂万古霉素发酵液,由本实验室提供;万古霉素3收稿日期:2006-11-13修回日期:2006-12-15作者简介:张一,1982年生,女(汉族),天津人,在读硕士研究生。主要研究方向:微生物药物研究。联系电话:135020161503通讯作者:张颖,E-mail:zhangyi1919@163.com128药物生物技术第14卷第2期进行。XAD-16树脂:依次用015mol/L硫酸甲醇溶液、015mol/L硫酸50%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水处理。NKA-Ⅱ、NKA-9、S-8、AB-8、NKC-9树脂:用工业乙醇浸泡24h,然后用工业乙醇洗涤树脂至流出液加蒸馏水不呈白色浑浊为止,用蒸馏水洗至无醇味。接着用5%盐酸洗涤,用蒸馏水洗至中性。最后用2%氢氧化钠洗涤,用蒸馏水洗至中性。11313静态实验将预处理过的树脂抽滤,室温晾干,分别称取115g干树脂,置于250ml锥形瓶中,加入25ml浓度为2152mg/ml的发酵液,振荡24h,检测此时万古霉素浓度,计算静态饱和吸附量。过滤并收集树脂,以011%盐酸洗涤,用50ml15%乙醇/011%盐酸/水作为洗脱剂解吸万古霉素,振荡24h,测定解吸液浓度,计算解吸量和解吸率。静态饱和吸附量(mg/g