实验三、鸡胚细胞的原代培养.ppt

实验三、 鸡胚细胞的原代培养 一、培养细胞生长的条件 1、细胞的营养需要 a、基本营养物质：氨基酸、维生素 b、促生长因子等物质 c、此外激素也可有助于细胞生长 培养液(medium)：培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。血清(FBS，FCS，CS，HS)、合成培养基， 如:DMEM、RPMI 1640和Ham F12等。 2、细胞的生存环境 a、温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 b、气相及pH: 5%CO2;pH: 7.2-7.4 。 3、无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件，细菌，病毒，支原体等。 二、 培养细胞的生长方式 1、贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 2、悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。各种造血系统肿瘤细胞  每代贴附生长细胞的生长过程 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，细胞增殖旺盛，活力最佳，最适合进行实验研究。此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡 机制：接触抑制、密度依赖性 提 纲 1.关于原代培养的概念 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作 原代培养的概念 原代培养?（primary?culture）：也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养的细胞生长比较缓慢。 原代培养? 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。 缺点：原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。 原代培养方式 组织培养 细胞培养 器官培养 培养方式 组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。 分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。 培养方式 器官培养：与组织培养相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法 原代培养的过程 取材——培养材料的制备 ——接种——加培养液—培养 1.取材 1）准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、 灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒 2.取材和培养材料的制备 A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润； B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液； C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。 取材注意事项 1. 取材要准确； 2. 因“材”制宜