SDS-PAGE检测重组蛋白.docVIP

SDS检测重组蛋白 一、实验目的 ① 掌握SDS的基本原理； ② 掌握SDS的凝胶制备方法； ③ 掌握蛋白质的考马斯亮蓝染色法； ④ 掌握测定重组蛋白分子量的方法。 二、实验原理： 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis），简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。催化剂过硫酸铵（AP）可产生自由基，而加速剂四甲基乙二胺（TEMED）可催化过硫酸铵加速自由基的产生，这样就可以形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除的作用，在制备聚丙烯酰胺凝胶时通常要进行抽气，或者用水或正丁醇隔绝氧气。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3~30%（V/V）之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3%（V/V）的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于SDS的浓缩胶，也可以用于分离DNA。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10~20%（V/V）的凝胶常用于SDS的分离胶。 聚丙烯酰胺凝胶具有以下突出的优点：（1）可以随意控制胶浓度和交联度，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子；（2）能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10-9~10-12 mol/L；（3）由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2-，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”；（4）由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好；（5）透明度好，便于照相、扫描或复印。机械强度好，有弹性，不容易破碎，便于操作和保存；（6）无紫外吸收，不需染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析；（7）还可以用作固定化酶的惰性载体。 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20多个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用得最更为广泛，常用于蛋白质的分离和分子量的测定，以及DNA序列分析过程中的DNA片段的分离和鉴定。 2、SDS 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定pH（碱性）缓冲体系中的分离。主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与超速离心、凝胶过滤相比，SDS不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在几个小时内得到结果，有较高的重复性，且不需要非常纯的样品，是目前为大家所接受的用于测定亚基的分子量的一种最好的方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，或用于变性蛋白的分离等。 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，在100℃加热3~5分钟，分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液； （3）用于SDS凝胶的考马斯亮蓝染色：甲醇，乙酸，考马斯亮蓝； （4）用于SDS凝胶的硝酸银染色：乙醇，乙酸，乙酸钠，25%戊二醛，硫代硫酸钠，，硝酸银，甲醛，碳酸钠，EDTA-Na22H2O。 3、主要仪器 玻璃制胶板，垂直电泳槽，电泳仪，染色与脱色摇床，凝胶成像系统。 四、实验步骤 1、SDS凝胶的制备 （1）正确安装制胶板，用琼脂糖凝胶密封底部及侧面，以免PAGE胶液泄漏。 （2）在150ml三角瓶中配置80ml 12%分离胶，混匀，沿玻璃板边缘缓缓加入制胶槽，加至距梳齿约1cm处，留出浓缩胶的空间。 12%分离胶（80ml）：26.8ml H2O，32.0ml 30%凝胶母液，20.0ml 1.5M Tris（pH8.8），0.4 ml 20%SDS，0.8 ml 10%AP，32μl TEMED。 注意：丙烯酰胺具有一定的神经毒性，操作时戴一次性手套；加入凝胶时动作要轻缓，以免产生气泡。 （3）用1ml移液器轻轻加入适量去离子水作为覆盖层静置约30min使凝胶完全聚合。 注意：水作为覆盖层可使凝胶表面变得平整，并可防止氧气对凝胶聚合反应的抑制作用。 （4）倒出覆盖层中的水，去离子水洗涤凝胶顶部数次，以去除未参与聚合反应的丙烯酰胺，用纸巾吸尽残留液体。 （5