分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】.doc

分子生物学第五章作业 1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？ 答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下： 1957年 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。 1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。 1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 年获得第一例转基因植物。 1984 年斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 年GMO首次在环境中释放。 1989 年DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--Oncomouse。 1996 年完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 年英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 2001 年完成第一个人类基因组全序列测定。 2004 年中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。 2、如何理解PCR扩增的原理及过程？ 答：（1）PCR的基本原理 首先将双链DNA在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，然后以单链DNA为模板，并利用反应物中的四种脱氧核苷酸合成新的DNA互补链。 （2）PCR的基本过程 加入模板DNA，PCR引物，四种核苷酸，即适当浓度Mg，DNA聚合酶，经过; 1.变性（Denaturation）：将待扩增的DNA模板加热变性成两条单链； 2.退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火； 3.延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。 3、简述定量PCR的原理和过程？ 答：（1）利用荧光测量的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的积累速力绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数问题。 （2）反应在带透明盖的塑料管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的激发光被激发，荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能被激发发出荧光，随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上得荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加。在这一过程中利用荧光测量的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的积累速力绘制动态变化图。 4、基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么? 答：构建原理上的区别： 真核基因组文库的构建是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆clone。汇集这些文库，应包含基因组中的各种DNA 顺序，每种顺序至少有一种代表，这样的克隆片段的总汇就成为基因组文库。 cDNA文库的构建：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体即cDNA文库。 用途上的区别： DNA基因库广泛用于细菌，真菌等基因组较小的物种的研究，及基因组作图，测序和克隆序列的对比。cDNA基因库可用于筛选基因，大规模测序，基因芯片杂交等功能基因组学研究。 5、基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的原理和用途。 答：基因克隆(gene cloning)：又称为重组DNA技术