双波长法用于磺酸型离子交换树脂吸附BSA+和Trypsin+的研究.pdfVIP

L049 双波长法用于磺酸型离子交换树脂吸附 BSA 和 Trypsin 的研究 1 邵勇军 魏荣卿，张婷婷，刘晓宁 ，姚忠 （南京工业大学制药与生命科学学院，南京 210009） 摘 要 将双波长法用于磺酸型离子交换树脂吸附蛋白的检测。结果表明双波长法比考马斯亮蓝 法和单波长法线性、重复性、稳定性要好。交换容量的增大能明显提高强酸型离子交换树脂对蛋 白的吸附速率和饱和吸附量。 关键词 双波长法 磺酸型离子交换树脂 牛血清白蛋白 胰蛋白酶 引 言 [1] 离子交换色谱是蛋白质类药物分离纯化中使用最广泛的色谱技术之一 。在离子交换色 谱应用中，其介质的吸附性能决定了分离纯化的效率[2]，因此起着关键作用。了解和预测各 种酶或蛋白质在介质中的吸附性能，将有助于过程的控制和放大。 常用于蛋白含量检测的方法有紫外吸收法[3,4]、考马斯亮蓝法[5,6]等。280 nm单波长紫外 吸收法简单、方便，但易受干扰，280 nm和 260 nm双波长法则对单波长法进行了改进，提 高了灵敏度和稳定性。考马斯亮蓝法迅速、灵敏度高，但相对紫外吸收法较复杂[7] 。本文在 相同条件下将 280 nm单波长法、280 nm和 260 nm双波长法及考马斯亮蓝法用于酸型离子交 换树脂吸附蛋白的含量检测，对三种方法的线性范围、重复性和稳定性进行了考察和比较。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 TU 1901 型紫外/可见光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）。牛血清白蛋白（BSA ） 为Amresco公司进口分装，胰蛋白酶为上海东风生化技术有限公司产品。考马斯亮蓝G-250 是Amresco公司进口分装。三羟甲基氨基甲烷（Tris ）为中国惠兴生化试剂有限公司产品。 磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸均为分析纯。磺酸型离子交换树脂(交换容量 3.17 和 4.88 mmol ·g-1)为南京麦科菲高效分离载体有限公司提供。 1.2 溶液的配制 1.2.1 缓冲液的配制 [8]进行。 所用Tris-HCl缓冲液（pH 7.6 ）和柠檬酸－磷酸缓冲液（pH 2.6 ）的配制按文献 1.2.2 胰蛋白酶 1 mg·ml-1溶液的配制 基金项目：国家自然科学基金（No；江苏省十五攻关项目基金（No.BE2001040）资助 通讯联系人：博士生导师.e-mail:xiaoningliu@163.com, 025 1 精确称取胰蛋白酶 100 mg，用适量 Tris-HCl 缓冲液溶解，充分混匀并定容至 100 ml 容 量瓶。置于 0～4 ℃冷藏备用。 1.2.3 牛血清白蛋白（BSA）1 mg·ml-1溶液的配制 精确称取牛血清白蛋白 100 mg，用适量柠檬酸－磷酸缓冲液溶解，充分混匀并定容至 100 ml 容量瓶。置于 0～4 ℃冷藏备用。 1.2.3 考马斯亮蓝溶液配制及考马斯亮蓝染色法操作 [7] 考马斯亮蓝染色液和考马斯亮蓝染色法操作按照文献 进行。 1.3 蛋白浓度标准曲线的绘制[7] 以 1 mg ·ml-1 蛋白样为母液，用缓冲液稀释配制成不同浓度标准溶液。于波长 280 nm 与 260 nm处测定吸光值，以吸光值A280nm和A260nm对标准蛋白浓度C回归，得双波长法标准 曲线方程；以吸光值A280nm对标准蛋白浓度作图得单波长法标准曲线方程；按照考马斯亮蓝 法在波长 595nm处测定吸光值，以吸光值A595nm对标准蛋白浓度作图得考马斯亮蓝法标准曲 线方程。 1.4 样品中蛋白浓度的测定 测定样