生物化学经典实验——糖的定量测定生物化学经典实验——糖的定量测定.pptVIP

实验一 糖类的定量测定——3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物： 在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。 该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少。 三、实验操作 1、样品总糖的水解及提取 准确称取山芋粉1克，放入大试管中，加入10ml 6N HCl和15ml蒸馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检查水解程度。 完全水解后, 冷却并加入酚酞试剂一滴, 以10% NaOH中和至溶液呈微红色, 先用双层纱布过滤, 再用滤纸过滤并定容至100ml。精确吸取上述溶液10ml放入100ml容量瓶、稀释至刻度, 备用。 2、制作葡萄糖标准曲线 2、制作葡萄糖标准曲线 将以上各管溶液混匀后，用分光光度计(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出标准曲线。 3、样品中含糖量的测定 取4支大试管，分别按下表加入各种试剂。 测定样品中含糖量时各试剂的用量 将各管混匀后, 按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度, 在标准曲线上查出相应的糖含量, 按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量。 1.实验过程中所有的试管要干净, 加入各种试剂量要准确。 2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。 3.分光光度计使用：溶液不要倒太多; 毛边不要对着透光处; 用后用自来水冲洗干净, 防回原处。 4.移液管使用：有色看外边缘, 无色看中间凹处。 5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂瓶等，以防试剂污染仪器。 * * 一、实验目的 1、掌握3,5-二硝基水杨酸法定糖的原理及方 法。 2、用3,5-二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中总糖。 3、熟悉分光光度计的原理及使用方法。 二、实验原理 光 密 度(O.D．520nm) 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 蒸馏水(ml) 立即用流动冷水冷却 冷 却 均在沸水浴中加热5min 加 热 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DNS试剂(m1) 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 2.0 蒸馏水（ml） 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0 葡萄糖液(ml） 6 5 4 3 2 1 空白 项 目 光 密 度 (O.D．520) 21.5 21.5 21.5 21.5 蒸馏水(ml) 立即用流动冷水冷却 冷 却 均在沸水浴中加热5min 加 热 1.5 1.5 1.5 1.5 DNS试剂(m1) 1.0 1.0 1.0 2.0 蒸馏水（ml） 1.0 1.0 1.0 0 样品量(ml） 3 2 1 空白 项 目 还原糖mg/ml×提取液体积×稀释倍数 总糖 = ×100％ 样品重量 3、样品中含糖量的测定 四、实验要求