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CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 1 简介1 原理：1 应用：4 技术介绍：6 技术优缺点：9 简介 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防 御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA 。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体 和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs ） 来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长 度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas 。 Cas 蛋白是一种双链DNA 核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切 割。它与folk 酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 原理： 此系统的工作原理是 crRNA （CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合 物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA 。而通 过人工设计这两种 RNA ，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第 一个统一因子（unifying factor ），能够共定位 RNA 、DNA 和蛋白，从而拥有巨 大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9 （Cas9 nuclease-null ）融合，并表达 适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标 DNA ，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融 合蛋白及 RNA ，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 1. CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM （NGG 序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer ；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重复序列； 最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。 2. CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) ： 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的 crRNA 前体，然 后逐步被加工成小的成熟的crRNA 。 3. CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互 补配对精确地与目标DNA 相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。 4. 应用： 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药 物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、 ES 细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很 高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较 成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一