口蹄疫病毒3ABC基因的遗传关系分析及表达.pdfVIP

摘 要 口蹄疫是一种危害猪、牛、羊等偶蹄动物的烈性传染病。控制和消灭该病的一 个重要问题是如何区分疫苗免疫动物和自然感染动物。动物接种口蹄疫灭活疫苗 后，产生口蹄疫结构蛋白抗体，而不产生非结构蛋白(NSP)抗体。所以，以NSP 为抗原。检侧动物体内是否有NSP抗体是一种很好的区分自然感染动物和疫苗免疫 动物的诊断方法。而在FMDVNSP中，检测多聚蛋白3ABC抗体又是确定动物感染最 可靠的指标。 采集出现口蹄疫临床症状猪的水泡皮，通过4日龄乳鼠分离、增殖病毒并测定 其病毒滴度。用病毒中和实验，间接血凝试验及RT-PCR方法鉴定其血清型。结果 确定其为0型口蹄疫病毒，并命名为FMDV0/GD/CC/2003. 参考猪源0型口蹄疫病毒作/朋流行毒株编码非结构蛋白3ABC的基因序列， 设计了一对特异引物 (3A/3C)，分别以GD5株猪源0型FMDV流行毒株墓因组为模 板。通过RT-PCR的方法获得其3ABC基因，并克隆到pMD18-T载体中.测序结果显 示:这5株0型FMDV流行毒株的3ABC基因cDNA均为12816p}编码由427个氨基 酸残基组成的多肚。同源性比较和系统发育树分析表明:5株0型FMDV流行毒株 亲缘关系密切。 以最新分离并鉴定的毒株0/FMDV/CC基因组为模板，以3A/3C为引物，通过 RT-PCR方法获得其3ABC基因，并克隆到原核表达载体pET-32a中，在大肠杆菌 BL21(DE3)中融合表达。SDS和Western-Blotting分析表明:FMDV3ABC基 因在大肠杆菌BL21中获得有效表达，表达产物具有良好的反应原性，从而为今后 以3ABC表达蛋白为诊断抗原，建立区分自然感染动物和疫苗免疫动物的ELISA方 法奠定了基础。 关键词:0型口蹄疫病毒 (FMDVType0) 3ABC基因 测序 克隆 表达 本论文常用英文缩写 Amp Ampicillin 氨节青霉素 by Basepair 碱基对 DBA Diaminobenzidineterahyochliride 二氨基连苯胺 DEPC Diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酸 g Gram 克 h Hour 小时 肠 Kilo-basepair 千碱基对 D K Kilodalton 千道尔顿 吨 Milligram 毫克 m n i Minite 分钟 m L Milliliter 毫升 P B s Phosphatebufferedsolution 磷酸盐缓冲液 P C R Polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 d m n l i Revolutionsperminite 每分钟转数 R N A l Ribonucleotideacid 核糖核酸 T R Reversetranscription 反转录 D s Sodiumdod