人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选研究.pdfVIP

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选 李晓琳盂明耀刘建生 李琦涵侯宗柳 18 中圆医攀科攀院中园协鞠医；科犬举医学生物攀研究所，既明淞650l 昆明市穗安医院， 昆明淞65∞5l 接鬃t秘的，城爨建的犬辫澄灌免瘦Fab暾菊体抗体库中瓣避疑谢抗掣避肝炎瘸毒(HAV)钒馘潘蚀瀚嗽馕悔摅 悔，并避衍鉴定。方泼：采用缒化扮甲型肝炎蓊游佟两包艘抗燎，瓣趣建的鑫爨为1．2酗101蕾＆≈叫豹f袖瞧壤体 抗体艨避行雀鬃帮游选，分铷对艨始艨耥筛避藤时抗体瘁避行Phge．班蕊A检测。经酶增鉴定襁D圣限测穆龄橱 舔遴行溅臼表达。缡聚z经2轮筛选，抗H真Ⅳ抗蔽的噬荫棒抗体祷到了嘲照誊繁，EHSA裳骚诞襄双肖怒好豹 抗甲肝瘸毒抗雅特铎雌。艇)s．E“逶拯溯瓣琢Fab抗体鬣自巍E瑚露D珐。巾槲到了袭遮。络沦：航翻建的馨堍筻篷 F曲蠛菌体抗体飕巾成功蔹褥了抗甲脐瘸鬻峨麓体抗俅，也嶷明所构建{|勺非免疫抗体艨W阁擎人瓣挫抗体的赫选 应用。 美键诩： 非免疫Fab噬荫体抗体库：瓣遵t托W 特异性免疫球鬣自作为一种被动免痰乎段，在甲型嚣于炎的防治巾其肖趱鼗作用。缎嘲为斑液传攒病镱 性痰躺的存在(如乙肝，丙肝，艾滋蛹等)，使瞧溉性兔液球缓臼的制备面临赣诲多蜒遂。利用擞菌体抗体 臻技术嗣蔷的入源性特异性抗体，为解决这熙阔遂提供了焚桃【J_j。曦蒲体抗体库技术将全套抗体蒸阏展示 在趱攘体袭两，雌j!奠方便地利用不同的抗原筛选所锵的抗体，穗豇许多变骏褥矸究袭嗍抗体朦库容最越犬、 多样性越好，就越诳隧从中筛选出识别浆一特定抗原的多种计；}闭抗体pj|。枣研究小组剥_l；{j这一技沭从泰经 免疫的健康人外周魄分随淋巴绷耱，成功构建了大席缀蘸(10儿plll触)豹噬蓠体抗体嫦，麓缀搴为9慨， 具商较好的多样镌。程验证了抗体露的弼蒜性和多样性的纂础～b以缝化的H斛为就抗艨聚用阁辋化抗 原吸附法对浚麾进行初步的筛选，并jc重筛选煞聚进行Phge．Ⅱ．IsA捡滞，结聚衮明。特黔控执HAV噬荫 体抗体得到r寂集，为进一疹徽功能方程霆的研究提供了莉艄变骏臻础。 l材料与方法 1．1材料 博士镄赙：辅助曦蔼体Va激13，大酗轩翁Ⅺ。1-Bl憾出中国疾瘸预防控制中心瘸礴镌鞭黼投制所鬃米箝 教授惠赠；纯化mW抗艨、王i．岛V抗体诊断试潮盒和大膊杆菌Ⅸ‰妇术所提供；限制性内切酶sa吐Xb趣 司；|王】mco畸ugated删a瓶．Ⅱ琳黼I舯L)购囟羹吼公司。F矗b抗体蒸因测摩弓l物巴 3’ vL：伽母seq：5-从GAC鼬GC．I猢℃aX栈【TGCAG V矗： CGGC础3cCG3’ pelseq：5ACCT肼G_I献：A 1．2抗体库的构建闭和库容滴定 分离入外例_崛淋致细胞，提取总擞蛆，逆转录溅c矾叮A，PCR扩壤轻链垒长翻爨链Fd段藻阏，携辍 l双酶切驻进行连接，电穿能转化感受态太肠轩瓣 链PCR产物与pC锄曲3XSS分别以适擞S鑫d和Xh )也1．Bme，构缝轻链库。轻链库和复链PCR产物缀)鼢l和S蚪双酶切艏连接电穿我转化感受态大瀚杆鬻 稀释，每个稀释魔器取l111分荆瀣子50牡l对数期跹l-B弧址藤澈，蜜溢孵商15min，镝【B·A《．Ampl00}L酗∞i) 甲鬣，剥定麾释。 ¨F曲噬藏体抗体誊集与淘选 以0．1mo垤，的碳羧盐缀冲滚(P珏9．6)稀释通蹙纯他的HAv全瘸毒抗繇，包被予Ⅱ璐A梗，3％B豁啜强S 封闭，麴新鳞制蠢的噬蒋体抗体上滴，37℃湿鑫孵肖2h；塌PB影＆雠n20(O．05％)洗每一礼，上“F瞅推 洗脱液棚剽2m1鞭瓣制蔷豹对数矧XLl．B蛔e中，宣溢孵育15min；取100}lI作lO吐～l旷稀释，滴定洗 20 隘F米的嘴薄体：其余捆入别预热的SA十T(鼬坤50飕细l鞫Tctpg越∞蟋养澈擎总体积为lO妇畦，37℃ 髹荡熔荐1 液歪总体积淘100ml，37℃振荡培葬2h：加K就至70删，37℃振荡培养过夜：次日离心收集上滴，翮 入PEG8∞O(终浓度4％)艘NaCl(终襻：度