人血清白蛋白融合人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的克隆表达研究.pdfVIP

中文摘要 目的构建重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子（pPIC9K-HSA-hG-CSF）表达载 体，用电转化方法将线性化重组表达载体质粒pPIC9K-HSA-hG-CSF 转化整合入 毕赤酵母宿主菌 SMD1168 中，甲醇诱导表达出具有生物活性的融合蛋白，对 转化子进行Western-blot 检测,用小鼠骨髓白血病细胞（NFS-60 ）细胞检测其 生物学活性。方法 PCR 扩增出人血清白蛋白基因（HSA）和粒细胞集落刺激因 子基因（hG-CSF），GGGGS 作为小肽接头，采用重叠PCR 的方法将HSA 和hG-CSF 拼接起来，与质粒载体pPIC9K 连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α 。抽提质 粒，用 SalI 酶切重组质粒，电转化法导入毕赤酵母 SMD1168 中，通过表型筛 选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌。将阳性转化子进行 PCR 鉴定和 Mut 表型鉴定并用甲醇诱导表达，将表达上清进行 Western-Blot 鉴定， NFS-60 细 胞测活实验测定其体外生物学活性。在摇瓶培养条件下，初步研究了甲醇诱导 浓度及菌体诱导起始OD600 值两因素对转化子表达水平的影响。结果 通过PCR 扩增技术成功获得 HSA-hG-CSF 基因，经测序验证结果正确。通过电转化方法 成功将酶切线性化重组表达质粒DNA 整合入宿主菌基因组，并在甲醇诱导下 成功表达出融合蛋白。在摇瓶培养试验条件下，通过对甲醇诱导浓度及诱导起 始OD600 值两因素对转化子表达水平的影响发现：在 0.5%~4.0% 的范围，随着 甲醇诱导浓度的升高蛋白表达量也升高，在其他因素固定时,菌体诱导起始 OD600 值在5~60 的范围内，随着OD600 值的升高表达量下降。Western-blot 分 析表明融合蛋白具有粒细胞集落刺激因子免疫原性。NFS-60 细胞测活实验分析 7 表明体外活性达到约 4.0×10 IU/mg。结论 成功制备了 pPIC9K-HSA-hG-CSF 表 达载体，该表达载体携带的HSA-hG-CSF 可以在毕赤酵母SMD1168 表达出目的融 合蛋白；表达的融合蛋白经过免疫学分析和测活试验表明通过本次研究成功表 达出长效白蛋白融合的人粒细胞集落刺激因子，为今后的药物研发提供了重要 的理论参考依据。 关键词 HSA-hG-CSF 融合蛋白 毕赤酵母 表达 I Abstract Objective Recombinant expression vector of human serum albumin and granulocyte colony-stimulating factor （HSA-hG-CSF ）was studied in this paper. The lined recombinant plasmid DNA was transformed into the competent Pichia Pastoris SMD1168 by electrotransformation. Expression of protein was induced by methanol. Converter`s character of immunology was detected by Western-blot and the biologic activity of fusion protein was detected by NFS-60 cell.Method DNA of HSA and hG-CSF was amplified by PCR, GGGGS as connector, combined HSA with hG-CSF by overlap PCR and ligated with pPIC9K, transformed into competent cell of Escherichia coli named DH-5α. Plasmid has been ext