线性表达载体、穿梭表达载体的构建及基因定点突变技术研究.pdfVIP

线性表达载体、穿梭表达载体的构建及基因定点突变技术研究 线性表达载体、穿梭表达载体的构建及基因定点突变技术研究 中文摘要 (一)随着模式生物和其它物种基因组全序列测序的完成，揭示基因的功能显得 日益重要，而基因表达则是研究基因功能不可或缺的手段。 1、构建线性表达载体研究基因的表达 利用杂交引物、非对称限制性内切酶和切口酶N.Bpu101结合核酸外切酶 Hl的方法构建线性表达载体，转染哺乳动物细胞，并观察绿色荧光蛋白的表 达。这种方法通过赋予PCR产物转录活性，无需转化和克隆筛选，可以快速实 现基因的表达。 2、构建穿梭表达载体 (pShutter)研究基因的表达 pShutter载体利用强启动子CMV实现基因在哺乳动物细胞中的表达，利用 T7/1ac杂交启动子在原核细胞中进行严谨调控，同时整合了V5亲和标签，6X His纯化标签和GFP-Blasticidin抗性筛选标记。它可以直接克隆PCR产物、方 便地检测和纯化蛋白，只需通过荧光即可监测细胞转染效率，而且该载体可用 于快速筛选稳定的细胞克隆。 (二)对于研究某个基因，可以对其进行一定的改造后，根据蛋白质表达水平或 生物学活性的变化来研究它的功能，基因定点突变技术无疑为改造基因提供了 有力的工具。 I、利用体外转录、DNaseI消化和反转录PCR实现高效率DNA突变 将 T7启动子序列和 IIS型限制性酶切位点引入突变引物的5瑞，通过 PCR扩增产生突变体DNA用于体外转录，合成RNA:利用DNaseI完全降解 模板 DNA和突变体DNA后;RNA用作模板经反转录PCR产生突变的双链 cDNA，后者再用限制性酶切割消化去掉T7启动子和US型限制性内切酶识别 序列。环化后转入大肠杆菌。利用该方法分别引入单点和两点突变，获得了 100%的突变效率。 线性表达载体、穿梭表达载体的构建及基因定点突变技术研究 2、利用T4DNA聚合酶和DpnI限制性内切酶实现DNA突变 该方法利用一条突变引物和一条通用引物来合成突变体DNA。质粒模板变 J性后和突变引物退火，在 T4DNA聚合酶作用下合成第一条突变链;反应混合 物经第二次变性，通用引物和新合成的链退火，T4DNA聚合酶催化再合成另 一条突变链。之后利用DpnI降解模板DNA和半甲基化DNA，终产物转化大 肠杆菌。与利用PCR进行定点突变的方法相比，该方法具有保真性高和聚合能 力强的优点。 关键词:线性表达载体，穿梭表达载体，基因表达，基因定点突变， 基因功能。 线性表达载体、穿梭表达载体的构建及基因定点突变技术研究 THECONSTRUCTIONOFLINEAREXPRESSIONELEMENTS ANDSHUFFLEEXPRESSIONVECTORALONGWITHSITE- DIRECTEDMUTAGENESISSTUDY By WenXIN(Zoology) DirectedbyDa-WeiHUANG Abstract (I)Withtheachievementofcompletegenomesequencesofmodelorganisms,it becomesmoreandmoreimportanttouncovergenefunction.Geneexpressionisthe absolutelynecessarymeansforgenefunction. 1.Geneexpressionbylinearexpressionelements Linearexpressionelements(LEES)areconstructedwithfragmentsgeneratedby hybridDNA/RNA primers,asymmetricrestrictionendonucleasecut,and combinationofnickaseN.Bpu101andexonucleaselII.ThentheconstructedLEESare transfectedintoChineseha