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含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建.pdf

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中 国 医 学 科 学 院学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE · 论 著 · 含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒 DNA 稳定复制细胞系的构建 向明确 ,蔡雪飞 ,张文露 ,黄爱龙 ,胡接力 重庆医科大学 重庆市第九人民医院感染科 ,重庆400700 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆400016 通信作者:胡接力 电话:023电子邮件:hujieli1977@163.COB 摘要 :目的 构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶 (RT)区的乙肝病毒 (HBV)DNA稳定复制细胞系。方法 采用巢式PCR从患者血清扩增HBVDNA片段,利用片段置换反应将该片段克隆到HBVDNA复制载体,并在该载体上 引入新霉素抗性基因,在确认该重组DNA体外可复制后,将其转染 HepG2细胞,G418筛选,采用rea1.timePCR结合 ELISA及Southernblot检测初筛和鉴定HBVDNA稳定复制细胞系。结果 从患者血清扩增出的HBVDNA片段nt55— 1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域,得到质粒pl1;新霉素抗性基因表达片段被克隆到pl1中HBVDNA下 游,获得质粒pl1一nee,Southernblot检测证实pl1一neo可支持体外复制;pl1一neo转染 HepG2后,经筛选鉴定,获得了 可支持HBVDNA稳定复制的细胞系3-10。结论 建立了含有临床病毒株聚合酶 RT区的HBVDNA稳定复制细胞系, real—timePCR结合ELISA有助于HBVDNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定。 关键词:乙型肝炎病毒;逆转录聚合酶;复制;稳定细胞系 中图分类号:R512.62 文献标志码:A 文章编号:1000-503X(2013)01—0013—06 DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.2013.01.003 EstablishmentofaStableCellL‘ineReplicatingHepatitisB VirusDNA Carrying theReverseTranscriptaseRegionDerivedfrom aClinicalIsolate XIANG Ming.que ,CAIXue.fei,ZHANG Wen—lu ,HUANG Ai.1ong。 HUJie.1i , DepartmentofInfectiousDiseases,theNinthPeople’SHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400700,China MinistryofEducationKeyLaboratory ofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,ChongqingMedicalUniversity, Chongqing400016,China Correspondingauthor:HUJie-liTel:023E—mail:hujieli1977@163.coln ABSTRACT:Objective Toestablishastablecelllinethatcanr

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