双自杀基因系统对结肠癌细胞靶向杀伤作用实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 双自杀基因系统对结肠癌细胞靶向杀伤作用实验研究 【摘 要】目的：研究观察腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统(以下简称AdKDR- CDg1yTK)对结肠癌的治疗作用并进行作用机理分析。方法：采用将人结肠癌细胞系SW620、LS174T移植接种于裸鼠腋下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将20只裸鼠每组五只随机分为四组。1组：注射重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5-FC和GCV；3组：注射重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK；4组：对照组。瘤体内多点注射重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK，5-FC和GCV采用腹腔内注射，观察各组裸鼠的状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理等指标；电镜观察细胞的超微结构，用TUNEL法检测细胞凋亡率，比较观察各治疗组的疗效；对各组的肿瘤组织行RT-PCR的检测，了解有无双自杀基因CDg1yTK的表达。结果：第1组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制，第2、3、4组肿瘤生长情况无明显差别。第1组肿瘤细胞凋亡指数较对照组显著增加（P=0.00）。结论 AdKDR- CDg1yTK联合前药5-FC和GCV对人结肠癌SW620、LS174T细胞具有明显的靶向抑制作用，并可诱导裸鼠体内人结肠癌SW620、LS174T细胞凋亡。 【关键词】结肠肿瘤；自杀基因；裸鼠；细胞凋亡 【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0427-02 近年来，结肠癌的病例逐渐增多，治疗效果也不理想，尤其是手术后复发常常困扰着广大医务人员。随着分子生物学及基因工程的迅速发展，基因治疗已成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法成为近年基因治疗的研究热点[1-3]。自杀基因疗法是一种酶前药系统，即一些非哺乳动物基因表达的酶能将无毒或低毒的前药在宿主体内转换成有毒的化学物质，杀伤肿瘤细胞，自杀基因还能通过“旁观者效应”扩大杀伤范围，并可先转染后治疗及诱导免疫等特点从而达到更好的治疗效果。本研究旨在探讨AdKDR- CDg1yTK联合前药5-FC和GCV对结肠癌的治疗作用，以及该体系能否诱导体内结肠癌细胞的凋亡。证实其有效性，并探讨其作用机理，为结肠癌的基因治疗提供新思路和实验证据。 1 材料、方法 1.1实验材料 重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK， 293细胞， SW620、LS174T细胞。RPMI-1640、小牛血清、、PBS， GCV， 5-FC。Trizol Reagent试剂盒。CD-TK引物为：上游引物5＇-AGGCTAACAGTGTCGAATAACGCT-3＇,下游引物:5＇-GTTAGCCTCCCCCAT CTC-3＇。SPFBa1b/c裸鼠,4-6周龄，雌性。 1.2实验方法 1.2.1重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定与鉴定见参考文献[4]。 1.2.2人结肠癌细胞SW620、LS174T培养。10%小牛血清的1640培养。37℃，5%二氧化碳孵箱培养，80%细胞融合按照1：2传代。 1.2.3重组腺病毒对SW620、LS174T细胞转染效率测定： 2times;105个细胞接种于6 孔培养板，细胞丰度达约90％时，加入不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)的目的腺病毒继续培养，3d后在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞的百分比。 1.2.4裸鼠移植瘤模型建立、治疗： 10%小牛血清RPMI-1640培养SW620、LS174T细胞，收集对数生长期的SW620、LS174T细胞，1000rpm离心后，在无血清RPMI-1640重悬，调节浓度，取细胞悬液0.1ml,含细胞数1.0times;107，接种SW620、LS174T细胞1.0times;107 /个于小鼠腋下，肿瘤直径达到0.5cm时，随机分4组，每组5只。1组：注射重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5-FC和GCV；3组：注射重组腺病毒AdKDR- CDg1yTK；4组：空白对照。1组和3组瘤体内多点注射腺病毒， 2次/周，共两周；第1次腺病毒注射24h后，1组于裸鼠腹腔内注射GCV(50mg/kgmiddot;d)、5-FC(500mg/kgmiddot;d)，连用14d；2组同时、同样、同量给药。瘤体内注射后每3d分别测量各组瘤体大小，计算方法：瘤体体积=atimes;b2 /2mm3 (a=长径，b=短径) 计算瘤体体积及生长曲线；治疗结束后，处死裸鼠，取0.1 mm3的肿瘤组织电镜观察。抑瘤率=(对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量，制作石