日本七鳃鳗RGD毒素肽的分子克隆、表达及对血管新生的抑制作用研究.pdfVIP

琏宁·土t 全国喀耳生曲杖术与辱洱弓静学术套议论文毒 2006．8．2-6 蛇毒纤维蛋白原溶解酶分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶Uo]。本实验室曾尝试采用检测丝氨酸蛋 属蛋白酶。蛇毒纤维蛋白原溶解酶又可分为Ⅱ型和p型[101。a型优先水解纤维蛋白原的Aa链，而对BB 链的水解活性较弱，这种蛋白酶通常是金属蛋白酶。而口型优先降解纤维蛋白原的BB链，而其对Aa链 具有相似的特性。 到鱼体表面，若干天后在给药部位几乎没有任何肌肉和粘连组织附着于表皮【2】。本实验室的结果也证 鳗捕食的需要。 日本七鳃鳗RGD毒素肽的分子克隆、表达及对血管新生的抑制作用 王继红吴毓韩晓曦孙晶李庆伟’ 辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所，辽宁大连，116029 RGD毒素肽候选基因．测序结果显示，其与已有报道的RGD毒素肽家族蛋白除具有RGD模体的共 性外，在蛋白质一级结构上没有同源性．对此三条候选基因进行克隆、转化与诱导后，得到了莫蛋白 的可溶性高致表达．经组氨酸素和层析纯化，获得了三条重组可溶性均质蛋白，并将其命名为 其均能明显抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管的新生作用：其对人脐静脉血管内皮细胞ECV304 的增殖、黏附．浸润及迁移也均有抑制作用，并能诱导ECV304细胞发生凋亡． 关键词：日本七鳃鳗RGD毒素肽，整合素，基因克隆与蛋白质表达，血管新生 与细胞整合素(integrin)间结合的强效竞争性拮抗剂，进而通过封闭整合素的细胞信号转导通路而 起到抑制血小扳聚集、抑制血管新生和抗肿瘤细胞增殖等作用”4)。 本课题组在先期对日本七鳃鳗口腔腺生物活性物质的研究中发现了三条RGD模体毒素肽候选基 因．并已对其进行了基因克隆、蛋白质的诱导表达及纯化，部分生物学功能及作用机制研究。本研究 将着重报道其抑制血管新生的生物学活性。 l材料与方法 1．1材料 +通讯作者E-mail：liqw咂263．Bet t宁·土t 套■唪耳t●技术与瘁耳焉■季术套诅语文毒 2006．8．2-6 1．1．1新鲜毒腺体取自于日本七鳃鳗。 Rosetta均为本实验室保存；组氮酸亲和层析柱(His·BindColumn)购自Novagen公司；人脐静脉内 皮细胞株ECV304购自武汉大学中国典型培养物保藏中心：细胞凋亡．Hoeehst染色试剂盒购自碧云天 EC 公司：碱性成纤维细胞生长园子(bFGF)购自PEPROTECHLTD．；人工基质膜matrigel购自美国 BD公司；Transwen细胞培养板购自美国Coming公司。 1．2方法 1．2．1 1．2．2 目的基因的获得及测序以RT-PCR获得的cDNA为模板进行PCR反应．获取目的基因。 J和Hind 1． 目的基因的克隆将目的基因与载体pET23b以NdeIJJ双酶切后】6℃过夜连接， CaCl2 法17崤化至大肠杆菌DH5a中，以T7通用引物PER及双酶切法进行阳性克隆的筛选与鉴定。 1．2．4 eDNA序列及其编码蛋白质的计算机分析从eDNA序列推导出它所编码的氨基酸序列，应 用NCBI 提供的BLAST程序在GenBank数据库和蛋白质数据库进行同源性比较分析。 1．2．5 蛋白质的诱导表达与纯化鉴定将经鉴定确认的阳性克隆提取重组质粒，CaCl2法转化至表 达菌BL21中。对重组菌进行不同时间与温度梯度的IPTG诱导表达。分别采用包涵体及可溶性蛋白 的提取策略进行诱导蛋白的提取，以含甘油的TficineSDS．PAGE小分子量蛋白质电泳法进行蛋白质 的鉴定以确定重组蛋白的存在形式；蛋白质的纯化采用组氮酸亲和层析柱(His·BindColumn)完成。 1．2．5重组蛋白Adinbitor的部分生物学活性测定 l工曼1采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)为模型测定Lamptfinl．3对体内血管新生的抑制作用 2结果 2．1 Lnmptrinl-3基因eDNA序列和同源性分析、功能预测 行PCR 扩增，获得了预期的