日本脑炎病毒SA14142株E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达研究.pdfVIP

——． △堕茎生竺垫堑堕塑型壅堑些墨篓塑—— 4—1 日本脑炎病毒SAl4-2株E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达 郑其升1，杨松。2，徐学清‘，张晓勇1，曹瑞兵1，陈德胜1，陈溥言” (1．南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疲重点实验室，江苏：南京2100952，沈阳农业大学畜牧兽 医学院， 辽宁；沈阳110161) 摘要：根据GenBarIl【公布的Japanese肋cepha]itJs 以包含体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间，确定了表达EⅢ蛋白的最佳诱导条 件：IPTG终浓度为0．1mmolL’，诱导时间为3h，在大肠杆菌中的最高表达量为54．9％。Westernblot 分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板，可以明显的区分JEv 阴阳性血清，并且不与PRY、CsFv、PRRsv、PPV、PCV的阳性血清发生反应，结论：重组JEVE¨I蛋白可以 用于检测猪血清中JEV抗体水平。 关键词：日本脑炎病毒囊膜蛋白克隆原核表达 日本脑炎(Japanese 性人畜共患传染病“1。近年来，随着全球气候变暖日本乙型脑炎流行范围有不断扩大的趋势”l。在动物中， 猪对JEV感染最为普遍，血清学检测猪抗体阳性率在90％、以上(赵书广。2001)。在日本脑炎的诊断中， 常用的补体结合试验、血凝和血凝抑制试验、中和试验等血清学检测方法只能在恢复期抗体水平升高时做 回顾性检测，不能早期诊断，而且，传统的检测方法都是全病毒操作。JEV通常只在仓鼠肾原代细胞上产 生病变，而在许多常用的传代细胞上不产生病变，这给病毒的增殖带来了困难，而且病毒抗原的制备过程 繁琐，缺少标准化，又存在感染人和向外界散毒的潜在危险性。ELISA方法具有快速、高效，特异性强， 灵敏度高等优点，可以同时检测多份血清样品。利用基因工程方法表达JEv主要结构蛋白的保守抗原区作 结构蛋白的保守抗原区，对其进行克隆和高效表达，为JBv新型ELISA抗体诊断试剂盒的研制奠定基础。 1 材料与方法 1．1实验材料 SAl4-14-2减毒株由江苏省农业科学院畜牧兽医所何孔旺研究员惠赠； 1．1．1病毒、细胞及载体JEV o均为本室保存。 BItK一21细胞、原核表达载体pET一32a(+)、宿主菌BL21(DE3)和DH5 1．1．2主要试剂及工具酶 病毒总RNA提取试剂盒购自罗氏诊断试剂公司；胶回收试剂盒购自上海华舜 生物工程有限公司；DMEM为GIBCO公司出品；新生牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司。 SA一14—14—2株核营酸序列，自行设计并由大连宝生物工程有 1．1．3引物设计参照GenBank公布的JEv I 限公司合成。为了便于基因的克隆及构建表达载体等后续工作，在上、下游引物57端分别加入Bali 和肼加m位点(引物中划线部分)： 453 人畜共患传染稍防治{jJ}究新成果}L编 BamHI 上游引物P1：57一TAAGGATCCCACCTGAAATGTAGGCTGA一3’ 下游引物P2：5’一cGG从GcTTG从GAccccTccAATAGA一3’ 肌删11I 1．2实验方法 1．2．1病毒增殖 一20℃下保存备用。 1．2．2 JEV囊膜蛋白基因(EⅢ)的扩增取500 L病毒悬液，按罗氏诊断试剂公司病毒总RNA提取试剂 9．2 盒操作说明进行。提取的病毒总RNA立即进行RT—PCR。反转录体系：病毒总RNA 4．0 L’dNTP2．0