实验二、转座子机突变及目标表型的筛选实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选.ppt

马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 现代微生物学实验技术 实 验 内 容 ? 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 转座子随机突变及目的表型的筛选 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 转座子随机突变及目的表型的筛选 李丽萍 实验目的 1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理 2. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程 3. 掌握双亲接合实验的原理及过程 实验原理 转座子： 转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。 转座子的发现： 20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学家McClintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分。 实验原理 细菌转座子的类型： 插入序列 (Insertion sequence); 复合转座子 (Composite transposons); Tn5 TnA 转座子家族 (TnA family); 可移动噬菌体 (Mu phage). 实验原理 Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座酶(Tnp)的作用位点。 kanr strr bleor OE IE IE OE IS50L IS50R P1 (Tnp) P2 (Inh) P3 P4 突变位点(Mutation site) Tn5的转座机理 实验原理 实验原理 DNA sequencing 实验原理 非转移性质粒： 转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移; 接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接 接触才能进行. 受体菌，Ap Nx 巴西固氮螺菌Sp7 供体菌 S17-1 质粒pRL1063a,Km 重组巴西固氮螺菌， Ap Nx Km 实验原理 植物生长激素， 由植物根系细菌合成，对植物的生长及一些发育阶段的调控起关键作用 细菌中IAA合成的几种途径 A-B：吲哚乙酰胺途径； E-F-D：吲哚丙酮酸途径； C-D：色氨酸侧链途径 实验材料 菌株 E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp7 2. 培养基及试剂 (1). 细菌丰富培养基 LB培养基 LD培养基 胰蛋白胨 (g) 10 10 酵母提取物 (g) 5 5 氯化钠 (g) 10 2.5 pH 7.0 6.8 固体培养基加入1.3% 琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min (2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基) (3).抗生素 抗生素名称 贮存液配制方法 氨苄青霉素 (Ap) 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 25 μg/ml 卡那霉素(Km) 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 50 μg/ml 30-50 μg/ml 萘啶酮酸(Nx) 20 mg/ml 水溶液，-20℃ 5 μg/ml E.coli A.brasilense 使用浓