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胰岛素类似物的生物制备 胰岛素类似物的生物制备 胰岛素类似物的生物制备 胰胰岛岛素素类类似似物物的的生生物物制制备备 摘要 速效胰岛素是一类通过基因工程方式获得的单体胰岛素，具有起效快，安全 性高等优点，是新型胰岛素类似物的一种。本论文通过基因工程方法制备两种单 体速效胰岛素。论文包括两个部分，第一部分是利用内含肽介导的大肠杆菌表达 系统制备单体人胰岛素 B22D(B22D-DesB30-insulin)；第二部分是利用毕赤酵母 表达系统制备单体人胰岛素 B27K-DTrI 前体 B27K。 B22D B 22 人胰岛素 是将人胰岛素 链 位精氨酸突变为天冬氨酸后得到的 具有单体性质的人胰岛素类似物。我们采用 pTWIN1-IMPACT 表达系统，经过 几丁质亲和纯化及内含肽自身剪切获得人胰岛素 B22D 前体的方法，操作简 单，快捷。在实验中，我们摸索得到的最优剪切条件是25 ℃，在不含尿素的 pH5.5 6 pH 8.0 缓冲液（ ）中剪切 天。剪切反应结束后，调节缓冲液 至 继续混 合2 小时可增加剪切液中人胰岛素 B22D 前体的含量。前体蛋白经胰蛋白酶酶 pH8.0 37 60min HPLC 切（ ， ℃， ）获得的产物通过 纯化及质谱鉴定证实为人 胰岛素 B22D。最终，人胰岛素 B22D 产量为0.621mg/L。 B27K-DTrI 是2005年由丁金国等人利用毕赤酵母表达系统制备的速效人胰 岛素，具有单体性质好，生物活性高等优点。但由于 B27 Lys DTrI在毕赤酵母中 表达量较低影响其进一步的生产应用。有研究表明胰岛素前体的自身聚合性质有 利于前体的稳定表达，从而可以提高蛋白在酵母中的表达量。因此，我们利用单 B 27 B 点突变的方法将胰岛素 链 位替换为赖氨酸。这样的设计既保留了原有的 链末端，又可以通过胰蛋白酶酶切的方式获得 B27K-DTrI。希望通过这一方法得 到的 B27Lys DTrI 前体（B27K）在毕赤酵母中的产量能够得到提高，达到最终 获取足够的单体速效胰岛素的目的。在工作中，我们筛选到了一株高拷贝、高表 B27K S 5L 达的 菌株（ 菌株）。对培养条件进行优化实验，得到了 发酵罐的最 优培养条件为 pH5.0，温度25 ℃，诱导108小时。在优化培养条件下，前体蛋 白 B27K 表达量可达114mg/L，高于原有的 B27K-DTrI 前体表达量。通过一系 列纯化方法（疏水作用层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和 HPLC 得到的 B27K 前体蛋白经质谱鉴定其分子量与理论分子量一致。 关键字： 关键字： 关关键键字字：：单体速效胰岛素，毕赤酵母，高密度发酵，内含肽表达系统， B22D-DesB30-insulin B27KDTrI ， 。 -1- 胰岛素类似物的生物制备 THEPREPARATIONOFINSULINANALOG