五溶菌酶的分离与活性测定.ppt

碱性磷酸酶（AKP) 的分离纯化及比活性的测定 目的要求 1. 学习碱性磷酸酶分离、纯化及活性测定的原理。 2. 掌握有机溶剂分步沉淀法的基本操作步骤和应用。 实验原理 酶是蛋白质，它的提取、分离与纯化的方法和蛋白质相似，一般有: 中性盐盐析法（如硫酸铵盐析等） 有机溶剂法（如乙醇、丙酮、乙醚提取） 电泳法（如聚丙烯酰胺凝胶电泳等） 层析法（如葡萄糖凝胶层析等） 通常要用多种方法配合使用，才能得到纯净的酶。 分离原理 有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。 有机溶剂能使许多溶于水的生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。 沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。 用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。 进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V－需加10 0％有机溶剂的体积 V0－原溶液的体积； S1－原溶液中有机溶剂的浓度； S2－要求达到的有机溶剂浓度； 100－指加入的有机溶剂浓度为100％。 采用有机溶剂沉淀法 采用标本：新鲜肝组织 破碎肝组织：组织捣碎机（同核酸提取） 匀浆液：低浓度醋酸钠――醋酸镁溶液 低渗破膜作用 保护、稳定AKP AKP分离纯化:应用有机溶剂沉淀法 蛋白质性质(电荷,分子大小,亲水性等),其沉淀(或变性)所需的有机溶剂及有机溶剂的浓度也不同,据此,利用不同浓度和不同种类的有机溶剂可进行蛋白分离. AKP在33%的丙酮或30%乙醇中-----溶解状态 50%的丙酮或60%乙醇中-----不溶状态(沉淀) 本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。 先用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆。 醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。 匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。 含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。 AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解 在50％的丙酮或60％的乙醇中不溶解的性质 操作步骤以下操作均在4~10℃进行。 （一）分离纯化 1.匀浆 兔肝2g，加入 2mL 0．01mol/L 醋酸镁-钠混合液，再加4mL ，混匀 此为A 液。 另取1支试管，取0.1mL A 液，加4.9mLTris缓冲液(pH 8.8)，混匀， 取0.1mL编号为AE，供测酶活性用。 另取1支试管，取0.1mL编号为Ap，供测蛋白质含量。 2.提取 加2.0mL 正丁醇溶液于上述剩余的匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌2min 左右。然后在室内放置5 min 后，滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中。 3.丙酮沉淀 于滤液中加入等体积冷丙酮，立即混匀后离心2min(8000 r/min)，弃上清，向沉淀中加入0．5mol/L 醋酸镁溶液4.0mL ，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为B液。 吸取0.1m1 B 液，置于编号为BE 的试管中，加入2.9m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。 吸取0.1m1 B 液，置于编号为Bp 的试管中，加入0.9m1Tris 缓冲液(PH 8.8)供测蛋白质浓度。 4.分步分离 于悬液加入100％冷乙醇，并使乙醇终浓度为30％，混匀，立即离心2min(8000r/min)，量取上清液体积。倒入另一离心管中，弃去沉淀。 向上清液中加入100％冷乙醇，使乙醇终浓度达 60％，混匀后立即离心2min (8000 r/min) ，弃上清。沉淀用2mL 0.01M醋酸镁-钠溶液充分溶解，记录体积，此为C 液。 吸取C 液0.1m1置于编号为CE 的试管中，加入0.9m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。 吸取C 液0.1m1置于编号为Cp 的试管中，加入0.4m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测蛋白质浓度。 (二)碱性磷酸酶的比活性测定 [原理] 比活性是指单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。因此，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐步升高，所以