精品第八章_外源化学物致突变作用.pptVIP

4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用。 质量控制 a）阴性对照组和阳性对照组的设立 b）盲法观察； c）资料处理； d）实验结果重现性。 阴性结果判定条件 阳性结果判定条件 * 三、常用的致突变试验方法 * （一）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 （Ames test ） 1. 原理 正向突变 野生型 突变型 回复突变 野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（his+），在 组氨酸缺乏的培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自 身不能合成组氨酸（his-），在组氨酸缺乏的培养基中不能 生长。如果细菌在受试物的作用下能在组氨酸缺乏的培养基 中生长，则说明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突 变作用。 * 2. 试验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株： TA97、TA98 ： 移码突变； TA100： 碱基置换； TA102： 移码突变+碱基置换 组氨酸缺陷（his-） 细菌屏障脂多糖缺陷（rfa 深粗型突变） ——结晶紫抑菌试验 切除修复系统缺损（△uvrB 突变） ——紫外线敏感试验 R因子（pKM101、pAQ1质粒） ——抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验 * 测试菌株（TA系列)特性 特性 TA97 TA98 TA100 TA102 移码突变 + + 碱基置换 + + hisˉ + + + + rfa + + + + R因子 + + + + 抗四环素 - - - + uvrB + + + - 自发回变菌落数 (-S9) 90-100 30-50 120-200 240-320 * ▲ 剂量设计: * 最高剂量的确定主要取决于受试物对实验菌株的毒性和受试物的溶解度. * 一般最低剂量为0.2μg/皿,最高剂量为5mg/皿. * 至少5个剂量,每剂量间隔不超过5倍. * 每剂量3皿. ▲对照组的设计: * 阴性对照: 溶剂对照 （H2O,DMSO) 未处理对照 * 阳性对照 * 推荐的标准诱变剂 方法 S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 点试 - 敌克松 敌克松 叠氮钠 敌克松 + 2-氨基芴 2-氨基芴 2-氨基芴 掺入 - 敌克松 敌克松 叠氮钠 敌克松 + 2-氨基芴 2-氨基芴 2-氨基芴 * 3.试验方法 平板掺入法 点试验法 预培养法 * 4.结果评价标准 阳性结果判断标准: ▲ 平板掺入法: 受试组回变菌落数≥阴性对照组回变菌落数的2倍,并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应. ▲ 点试法: 如受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落,与阴性对照组相比有明显区别. * 结果报告(平板掺入法) 阳性结果至少重复试验共3次,阴性结果至少重复试验共2次,才能作出判断. 本方法不适合用于杀菌和/或抑菌作用的受试物,不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物. * （二）微核试验（micronucleus test) * （三）小鼠精子畸变试验 （四） 染色体畸变分析（细胞遗传学试验） （五）单细胞凝胶(SCGE)试验 ——慧星试验（comet assay) * (六)小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-基因正相突变试验 * 原理 : 在5-三氟胸苷(TFT)参与下，通过评价细胞集落生长率来鉴定受试物诱导L5178YTK+/-小鼠淋巴瘤细胞系正相突变能力。 TK座位位于常染色体上,其基因产物为胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)激酶（TK）.其作用是通过磷酸化将基质中外源性的胸苷用于DNA合成.如果一个胸苷类似物（如TFT）存在于基质中,也可经TK途径磷酸化掺入DNA中,最终导致细胞死亡。 * 本试验使用的TK座位杂合子(TK+/-)细胞，它单步正相突变就会形成TK+/-表型，失去TK活性，获得TFT抗性，即能像杂合子一样利用从头合成途径在普通培养基中生长，又能在TFT选择性培养基中存活，此时存活的即为自发或致突变的TK+／-集落． * ２.测试用细胞 小鼠淋巴瘤细胞L5178细胞系，源于小鼠白血病细胞，为TK座位杂合子细胞（TK+/-)． ３.操作方法（略） ４.结果