华勃氏呼吸计法测定L-谷氨酸.ppt

华勃氏呼吸计法测定L-谷氨酸 实验目的 了解华勃氏呼吸仪测定气体变化的原理。 掌握华勃氏呼吸仪测定气体变化的具体操作。 实验原理 华勃氏呼吸计法基本原理是在一密闭的、定温定体积的系统中进行样品气体变化的测定。当气体被吸收时，反应瓶中气体分子减少，压力降低；反之，产生气体时，压力则上升，此压力的变化可在测压计上表现出来，由此可利用气体定律计算出产生的CO2或吸收O2的量。此法可用于细胞、线粒体等耗氧速率和发酵作用的测定，也可进行研究其他有关和O2和CO2气体交换反应，如呼吸作用、光合作用、脱羧酶和氧化酶的活性等。 大肠杆菌菌体内含有L-谷氨酸脱羧酶，能专一地催化L-谷氨酸脱羧，释放出二氧化碳。利用华勃氏呼吸仪测定并计算出二氧化碳量后，可进一步求出L-谷氨酸含量。 仪器、原料和试剂 仪器：移液管2ml、0.5ml、0.2ml、0.1ml；2ml注射器；瓦氏呼吸仪1套。 原料： （1）大肠杆菌-丙酮粉的制备：将纯化的大肠杆菌由试管斜面培养接种到10支200ml茄形瓶培养基上，于37℃培养16～18h。 （2）培养基的配方如下： 蛋白：10g 牛肉膏浓缩液：5g 琼脂：20g 蒸馏水：1000ml 每一茄形瓶加入少量0.9%氯化钠溶液，洗下菌体（可洗二次），菌体悬液离心（2500r/min）弃去上清夜，沉淀（菌体）悬浮于少量生理盐水中，置冰箱中冷却至20℃。 向已冷却的菌体悬液中加入10倍体积的冷丙酮（-10℃），边加边搅拌10min，静置，待菌体沉淀后，倾去上清夜，菌体用布氏漏斗抽滤，并用冷丙酮洗菌体1～２次，滤液置于干燥器内减压干燥，所得大肠杆菌-丙酮粉装于密封瓶内，冰箱保存，数日内有效（现制备的要放入冰箱40h后，取出研磨粉备用） 试剂： ①乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）： A液：3mol/L乙酸钠溶液。称取CH3COONa?3H2O（相对分子量136.09）40.8g溶于蒸馏水中，然后定容至100ml。 B液：2mol/L乙酸溶液。称取12g乙酸加蒸馏水定容至100ml。 将A、B两液按7：3（体积比）混合即得，使用时事先用pH计校正。 ②0.5mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）：称取30g冰乙酸加入12g CH3COONa?3H2O，溶解后放入100ml定量瓶中，用蒸馏水稀释至 刻度。也可用3mol/L乙酸缓冲液稀释制得。 ③2%大肠杆菌-脱羧酶液：称取2g大肠杆菌-脱羧酶-丙酮粉，用pH5.0 0.5mol/L的乙酸缓冲液定容至100mL。 ④0.05mol/L L-谷氨酸溶液：准确称取L-谷氨酸0.7360g，用蒸馏水定容至100ml。 ⑤检压液（或称布洛的氏溶液）：称取NaCl 23g，牛胆酸钠5g，伊文氏蓝0.1g（相对分子质量960.83）（如没有，可以用0.1g甲基蓝或酸性品红代替）。混合后再加麝香草酚蓝酒精溶液数滴（防腐）（1g麝香草酚蓝溶于100ml 40%酒精中），用蒸馏水定容至500ml，相对密度为1.033，使用前需校正，若相对密度高于1.033时用蒸馏水调，低时用NaCl调。 实验步骤 1．将测压管固定于铁架上，放松螺旋压板，用注射器在橡皮管内加入检压液至刻度50mm处。 2．按下表在反应瓶中加入各试剂。反应瓶侧管瓶塞和压力计三通塞均涂以凡士林后塞紧。压力计口亦涂上凡士林和反应瓶连接，轻轻转动反应瓶，使封口凡士林呈透明，然后用橡皮筋将反应瓶固定在压力计上。 3．在水箱内加入温水至水箱上部6cm处，调节水银触点温度计至37℃。打开电源开关和加热开关，升温至酶反应温度37℃。 4．将两副压力计固定在水槽上，使反应瓶进入水浴中。保温振荡10min（120转/ min），当反应瓶内温度与水槽温度平衡后，关闭三通活塞，调节螺旋夹，使左右两侧检测液面高度不同（左侧开口端液面约在230mm处），记录液面高度，10min后检查液面是否发生变化。如无变化，表示测压计不漏气，可以开始测定。 5．转动三通活塞，使与大气相通，调节螺旋夹，使右侧（闭管，但此时与大气相通）管内液面在150mm处（参比点），记录左侧（开口端）液面高度，此为反应前读数，关闭三通活塞。 6．用左手食指堵住测压管左侧口，取出测压装置，将反应瓶侧室中的酶液倾入主室中，摇匀（注意勿使液体堵住气体出口），立即放回水槽中，并