色谱分析（中国药科大学） 超高效液相色谱(UPLC).docVIP

超高效液相色谱(UPLC) 超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7μm），而且需要耐压的色谱系统(15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。世界第一个商品化UPLC产品Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统 图1：填料技术的沿革 1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。 在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。 图2: 范德米特(van Deemeter)曲线 1.1 超高分离度 根据等度液相色谱分离的分离度(Rs)方程，分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正比。 ……………(1) 按Van Deemter色谱理论，柱效(N)与颗粒度(dp)成反比： …………(2) 故：随着dp的降低，N值会增加；而N值增加，则Rs值增加。HPLC与UPLC的基本分离理论，进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。 新一代UPLC系统发挥了1.7 μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7 μm颗粒提供的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7 μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70％。在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。 UPLC用1.7 μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰（见图3），从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。图3显示UPLC可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。 图3: UPLC与HPLC：分离度比较 1. 2 超高速度 较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。因为颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变(见式3)，而且Van Deemter理论表明最佳流速与粒度成反比(见式4)。柱长缩短会加快分离速度，而颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。 ……（3） 由于新一代UPLC系统用1.7 μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。 1.3 超高灵敏度 过去几年中，提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学检测器和质谱检测器。这种趋势主要是受要求检测化合物的浓度越来越低（如高效药物）的驱动。然而采用超高性能色谱系统就能获得灵敏度的显著提高。 在UPLC中始终可得到较高的灵敏度。UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽(见式5），即更高的灵敏度。 因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了(见式6)；同样，当UPLC用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加 (见式7)。因此，使用UPLC技术，不仅可以在保持与HPLC相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。 图5: HPLC到UPLC：灵敏度的改善无需折衷 1.4 UPLC为最佳的质谱入口