胶迁移实验步骤.pdfVIP

胶迁移实验步骤 实验步骤 生物素标记探针 1 按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩 超纯水 25μl 5×TdT Reaction Buffer 10μl 探针(1μM) 5μl Biotin-N4-CTP 5μl TdT (2U/μl) 5μl 37℃反应30 分钟 2 加入2.5μl 0.2M EDTA 终止反应 3 加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g 离心2min ，保留上层水相，－20 ℃保存。 4 结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4 ℃，待用。 抽提核蛋白 6 1.2-3×10 密度铺60mm细胞培养板，培养约12h 2.移去细胞培养基，PBS 洗细胞一次 3.加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL 离心管 4.1000g 离心2min ，吸去上清 5.加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min 6.加入40μl 含2.5 ％NP-40 的Buffer A ，涡漩10s，4 ℃ 15000g 离心5min 7.吸去上清，加入40μl Buffer C，4 ℃涡漩25min ，4 ℃ 18000g 离心5min 8.吸取2μl 上清采用Bradford 法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃ 配置非变性聚丙烯酰胺凝胶( 以6 ％浓度为例) 5×TBE 1mL 30 ％Ac-Bi 2mL 40 ％Glycerin 625μl DDW 6.125mL 10%AP 150μl 10%TEMED 100μl 以预冷为4 ℃的0.5×TBE 为电泳缓冲液，100V 预电泳30-60min EMSA （参考PIERCE 公司试剂盒） 特异性的证明 首次使用的探针序列需证明其是否与目的蛋白特异性结合，确定目的条带的位置。 按照“步骤”中的体系，做以下四组平行结合实验： （在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC) 的基础上) 1) 生物素标记的探针 2) 蛋白质粗提物 3) 蛋白质粗提物＋200 倍浓度的非标记的同种探针 4) 蛋白质粗提物＋200 倍浓度的非标记的突变探针 室温反应10min，然后加入生物素标记的探针 室温继续反应20min ，做EMSA 检测 结果分析，如果出现如下实验结果 1) 显示游离探针位置 2) 显示游离探针位置和迁移带位置 3) 只有游离带，没有迁移带 4) 和2)带型一致 则证明探针与目的蛋白为特异性结合。 步骤 1.按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl 体系） ddw ―― 10×binding buffer 2μl Poly(dI.dC) 1μl 核蛋白粗提物 4 －10μg （温和混匀） 生物素标记的探针 0.5μl 室温反应20min ，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上样10－20μl，100V 电泳至 溴酚蓝于三分之二处。 2. 电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE 至少10min 以预冷的0.5×TBE 为电转缓冲液100V 转胶于尼龙膜上，45min 3.UV BOX 下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm 激发光交联15min 4.加入25mLBlocking Buffer ，以约70rpm 在脱色摇床上封闭30min 5.将SA-HRP 以1:30000-50000 稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm 作用20min (洗膜过程全部在