醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（９）：１２～１６ 醛糖还原酶抑制剂细胞筛选模型的建立 刘　静　刘建伟　杜明梅　杨立娜　叶　玲 （中国人民解放军总医院老年医学研究所　北京　１００８５３） 摘要　目的：将糖尿病慢性并发症相关基因醛糖还原酶 （ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＡＲ）基因与腺相关病毒 （ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）表达载体ｐＳＮＡＶ２．０重组，使其在ＨＥＫ２９３细胞中表达，以基因工程表达 的ＡＲ为靶向，建立醛糖还原酶抑制剂 （ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＡＲＩ）细胞筛选模型。方法：首先采 用酶切、连接等方法构建含有人ＡＲ基因序列的ＡＡＶ表达载体ｐＳＮＡＶｈＡＲ，将重组质粒转染ＨＥＫ２９３ ? 细胞，通过活性测定、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光检测目的基因转染及表达的情况。结果：ＰＣＲ、酶切、ＤＮＡ 测序均证实表达质粒ｐＳＮＡＶｈＡＲ构建正确。转染ＨＥＫ２９３细胞后，一系列分析结果显示，腺相关病毒 ? 表达载体介导的ＡＲ真核细胞表达产物是具有功能活性的目的蛋白。应用经典醛糖还原酶抑制剂 Ｓｏｂｉｎｉｌ和Ｚｏｐｏｌｒｅｓｔａｔ对此模型进行了验证。结论：ＡＲ高表达细胞模型的建立，为进一步筛选ＡＲＩ、探讨 多元醇通路学说在糖尿病慢性并发症发病机制中的作用奠定了基础。 关键词　醛糖还原酶　腺相关病毒　细胞模型 中图分类号　Ｑ７８９ 　　随着糖尿病病程的发展，糖尿病患者中多合并发 生高血压、冠心病、肾病以及血管病变等糖尿病慢性并 发症（ｄｉａｂｅｔｉｃｃｈｒｏｎｉｃｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＤＣＣ）。ＤＣＣ发生 的具体机制尚未完全明确，与其有关的多种机制中多 元醇通路（ｐｏｌｙｏｌｐａｔｈｗａｙ，ＰＰ）的激活，已经得到广泛的 认可。ＰＰ是葡萄糖代谢的途径之一，由醛糖还原酶 （ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＡＲ）及 山梨醇脱氢酶 （ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＳＤＨ）共同构成，ＡＲ是 ＰＰ的关键限速 图１　多元醇通路示意图 ［１］ 酶。葡萄糖代谢途径示意图见图１ 。 Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐｏｌｙｏｌｐａｔｈｗａｙ 　　当血糖浓度维持在正常生理水平时，细胞内大多 数葡萄糖可被己糖激酶转化为６磷酸葡萄糖，只有少 和组织受损，这就是ＤＣＣ发病机制的多元醇代谢途径 ? 量非磷酸化的葡萄糖进入ＰＰ。在高血糖状况下，己糖 激活学说。ＡＲ激活已被证实是ＤＣＣ的重要发病机制 ［１，２］ 激酶被葡萄糖饱和，占总流通量 １／３以上的葡萄糖涌 之一 。研究表明，醛糖还原酶抑制剂 （ａｌｄｏｓｅ 入 ＰＰ。ＡＲ被激活，消耗大量 的还原型辅酶 Ⅱ ｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＡＲＩ）可以抑制ＡＲ活性，有效的改善 ＋ 高血糖状况下ＡＲ被激活引起的异常情况，从而达到预 （ＮＡＤＰＨ）和氧化型辅酶Ｉ（ＮＡＤ ）。细胞内山梨醇和 ［３，４］ 果糖积聚，由于山梨醇对细胞膜的通透性较差，氧化生 防和延缓ＤＣＣ的目的 。 成的果糖又难以代谢，导致细胞渗透压显著升高，细胞 　　重组腺相关病毒载体（ｒＡＡＶ）源于非致病的野生 型腺相关病毒，属于无病毒基因的病毒载体。由于其 收稿日期：２００９０１１９　　修回日期：２００