肠出血型大肠埃希菌o104∶h4转运蛋白aata单-中华疾病控制杂志.pdfVIP

·５７２· ＣｈｉｎＪＤｉｓＣｏｎｔｒｏｌＰｒｅｖ　２０１７　Ｊｕｎ；２１（６） 肠出血型大肠埃希菌Ｏ１０４∶Ｈ４转运蛋白ＡａｔＡ 单克隆抗体制备及鉴定 邵娜，李以圣，王湘雨，华颖，万成松 　　【摘要】　目的　表达肠出血型大肠埃希菌Ｏ１０４∶Ｈ４的融合蛋白ＧＳＴＡａｔＡ，获得单克隆抗体。方法　人工合 成肠出血型大肠埃希菌Ｏ１０４∶Ｈ４的转运蛋白基因ａａｔＡ，连接至ｐＭＤｌ８Ｔ载体，转化ＥｃｏｌｉＤＨ５，双酶切回收，构建 α 原核表达质粒ＰＧＥＸ６Ｐ１ＧＳＴＡａｔＡ，测序鉴定后，转化ＥＣｏｌｉＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳＰＡＧＥ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分 析目的蛋白的表达并纯化该重组蛋白。将纯化后的融合蛋白ＧＳＴＡａｔＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，制备相应单克隆抗体；并 对该单克隆抗体的纯度、亚型、效价、特异性进行鉴定和分析。结果　构建的原核表达载体ＰＧＥＸ６Ｐ１ＧＳＴＡａｔＡ能 表达融合蛋白ＧＳＴＡａｔＡ；亲和层析纯化后融合蛋白ＧＳＴＡａｔＡ纯度达到９５％，免疫小鼠后得到相应特异性单克隆 抗体。结论　成功制备出一株抗转运蛋白ＡａｔＡ的单克隆抗体，该抗体为ＩｇＧ１亚型，特异性好，效价高，纯度可达 ９７％。 【关键词】　肠出血型大肠杆菌；抗体，单克隆；抗体特异性 【中图分类号】Ｒ１１７　　　　 【文献标识码】Ａ　　 【文章编号】１６７４３６７９（２０１７）０６０５７２０５ ＤＯＩ：１０．１６４６２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｚｈｊｂｋｚ．２０１７．０６．００８ ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＥＨＥＣＯ１０４∶Ｈ４ＡａｔＡｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＨＡＯ Ｎａ，ＬＩＹｉｓｈｅｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｎｇｙｕ，ＨＵＡＹｉｎｇ，ＷＡＮＣｈｅｎｇｓｏｎｇ．　ＢｉｏｓａｆｅｔｙＬｅｖｅｌ３Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５１５，Ｃｈｉｎａ 　　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｅｘｐｒｅｓｓＥＨＥＣＯ１０４∶Ｈ４ＧＳＴＡａｔＡｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ ｂｏｄｙｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＡａｔＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅａａｔＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙ ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉＤＨ５．ＴｈｅｒｅｃｙｃｌｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｐｌａｓｍｉｄＰＧＥＸ６Ｐ１ａｎｄ α ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＧＥＸ６Ｐ１ＧＳＴＡａｔＡｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１．ＩＰＴＧｗａｓａｄｄｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＳＤＳＰＡＧＥ ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ．ＴｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇＢａｌｂ／ｃｍｏｕｓｅｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄＧＳＴＡａｔＡｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ ｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｆｏｒｔｈｅｐｕｒｉｔｙ，ｓｕｂｔｙｐｅｓ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｔｉｔｅｒｔｈｅｒｅａｆｔｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＧＥＸ ６Ｐ１ＧＳＴＡａｔＡ