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微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法姓名摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。实验结果表明，本实验达到了预期的目的。关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法1.引言自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。（2）平板分离法：微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。随着分子生物学的发展和学科的相互渗透，微生物的分离鉴定技术将获得新的突破。目前发展的PCR、16S rRNA探针杂交技术、荧光抗体技术等已开始用于自然环境中某些特殊微生物的分离、鉴定，特别是对那些现在认为是非可培养的微生物。平板分离纯化技术的基本原理包括两方面：第一，选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。第二，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，适用于细菌、酵母等单细胞微生物以及放线菌和霉菌的孢子，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，我们常用菌落形成单位CFU来表示，由此得到的计数结果的单位是CFU/mL，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。2.材料和方法材料和试剂实验菌种：大肠杆菌实验培养基：150mL LB固体培养基实验仪器：无菌玻璃涂棒、5支1mL无菌吸管、接种环、10套无菌培养皿、5支盛有4.5mL无菌水的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、高压蒸