细胞室无菌技术标准操作规程.docVIP

细胞室无菌技术标准操作规程 一、无菌室的灭菌 1. 定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。超净台上滤网需每月清洗1次。 2. CO2孵箱（培养箱）灭菌：用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。 3. 实验前灭菌：打开紫外灯、超净台各20-30分钟。在开紫外灯杀菌前，应确认无菌室无人后方可开紫外灯杀菌。 4. 实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 ５．定期检测下列项目：钢瓶之CO2压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之气流压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。 6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。 二、实验人员的无菌准备 1. 肥皂洗手； 2. 穿好隔离衣，放好拖鞋； 3. 用75％酒精棉球擦净双手； 三、无菌操作的要点 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面； 2.靠近酒精灯火焰操作； 3.器皿使用前必须过火灭菌； 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火； 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 （7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。? 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 （2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 4