实验三 革兰氏染色法.ppt

实验三 革兰氏染色法 内蒙古科技大学 基础生物实验中心 * * 一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。 二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。 Gram stain of Gram - Gram stain of Gram + 细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、器材： 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液， 载玻片，显微镜等 四、操作步骤： 1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌 （24h）分别涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1--2分钟，水洗 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。 五、实验报告： 1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。 2、思考题： 1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？ 2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 实验六 显微镜直接计数法测定 微生物数量 一 目的要求 1.明确显微镜计数的原理 2.学习使用血球计数板进行微生物板计数的方法 二 基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的，可根据观察到的数目换算成单位体积的总数目，此法计得的是死活菌的总数，故称总菌计数法。 血球计数板刻有两方格网，每网分九大方格，中间为计数室。计数室为25×16（16×25）小方格。计数时常数五个中格的总数，换算出1ml中的总菌数。 三 器材 酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片， 无菌毛细管，吸水纸 四 操作步骤 1 稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必稀释。 2 镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则进行清洗。 3 加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。 4 显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选四角和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。 5 清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行凉干。镜检，洗净为止。 五．实验报告：1 结果；2 思考题：第（1）题。 实验七 培养基的制备和灭菌 一 目的要求 1、明确培养基的制备和高压蒸汽灭菌的原理。 2、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制培养基和高压蒸汽灭菌的方法。 二 基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，又称普通培养基。其配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15—20g 水 1000ml PH 7.4—7.6 其中，牛肉膏：碳源、