中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症基因检测方法的建立与应用研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 中国荷斯坦牛自细胞黏附缺陷症基因检测方法的建立与应用 王洪梅1李建斌’高运东1张秀红2刘文浩1仲跻峰件 (1．山东省农业科学院奶牛研究中心，济南250100；2．山东奥克斯生物技术有限公司，济南250100) 摘要 本试验根据已知牛染色体上CDl8编码基因序列设计引物，提取牛血液和精液DNA，可扩增 合母牛(携带者)，占检测母牛群的o．84％，在荷斯坦公牛中只检测到一种基因型，没有发现隐巨突 变基因的携带者． 关键词荷斯坦牛，牛白细胞黏附缺陷症，PcR_RFLP，测序 牛白细胞黏附缺陷症(Bovine Adhesion Leukocyte 因突变，引起白细胞粘附及相关的功能包括吞噬和趋化作用的缺陷，以严重的重复性感染、缺少脓 液形成、损伤愈合延迟和白细胞增多症为特征，多发生于1～14个月龄的Holstein牛，两性均可发 发现存在两个位置的点基因突变，其中775位的碱基由T突变为C，其对应的氨基酸都是亮氨酸， 而不发病；但位于383位的碱基由A变为G，与之相应的位于胞外高度保守区的128位的天门冬氨 酸变成了甘氨酸，致使白细胞表面的B2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。同时这一突 变可导致DNA序列上Taql酶切位点的消失，为此根据该位点的有无，通过提取血液和精液DNA，利 用PCR—RFLP方法，检测牛群BLAD杂合子，而不受奶牛年龄、性别等因素的影响。 1 材料和方法 1．1 样本的来源济南市周边11个奶牛场356头荷斯坦奶牛的抗凝血，山东奥克斯荷斯坦奶牛种 公牛站的53份公牛冷冻精液。 1．2试剂 1．2．1血液DNA提取试剂盒、限制性内切酶TaqI、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker均购自TaKaRa 公司；Amp、X-Gal、IPTG购自华美生物工程有限公司。 1．2．2 引物参照Berand 1．2．3DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司 1．2．4大肠杆菌JMl09为本室保存、载体质粒pMDl8-T购自TaKaRa公司 1．2．5重组质粒的纯化及DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司 1．3基因组DNA的提取 血液样本采用酚法提取DNA，详细操作步骤见文献H’：精液样本采用蛋白酶K两步消化法，酚一 氯仿法，详细操作步骤见文献哺1。 1．4 PCR—RFLP Il 1．4．1PCR扩增及检测分析PCR扩增体系为25l，其中DNA模板1Il 2．5ul，dNTPS0．2mmol／L，引物各5pmol，MgCl21．5mmol／L，TaqDNA聚合酶2U，混匀后于PCR仪内 项目基金：山东省良种产业化项目(2003-2009)；山东省农科院青年科研基金项目(2005Y0048) 作者简介：王洪梅(1974一)，女，山东临沂人，奶牛育种，E-Mail：homey68@163,com 417 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 lOmin，降温至4。C结束。取适量PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。 1．4．2产物的回收将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下含特异性扩增片断的琼脂糖，然后 按使用说明用回收试剂盒进行PCR产物的回收。 1．4．3PCR产物的酶切及分析取回收的PCR产物用限制性内切酶TaqI进行酶切。取适量的酶切 产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳。 1．5CDl8基因的克隆、鉴定与序列测定 1．5．1 u u 体系，再加入2×SolutionI溶液7．5l，补加无菌去离子水至15l，混匀后于16。C连接。连接 板上，37℃培养过夜。挑取生长良好的数个白色菌落分别接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振 荡培养，按碱裂解法提取质粒DNAⅢ。 1．5．2质粒的酶切鉴定将初选的阳性质粒用ECORI和ItindIII，作双酶切鉴定。 1．5．3质粒的PCR鉴定取上述两项鉴定为阳性的质粒作100倍稀释，取1．5u1为模板进行PCR 扩增，反应体系及循环参数同1．4．1。 1．5．45’端核酸序列测定对经酶切和PCR鉴定为阳性质粒的5’端进行序列测定，测序由上海 生工生物工程技术服务有限公司完成。 2