左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯对HL-60细胞Bax蛋白表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯对HL-60细胞Bax蛋白表达的影响 杨小叶 杨斌 刘元 吴桂甫 凌兰兴 曹斌 (通讯作者)（广西医科大学药学院 广西南宁 530021） 【摘要】 目的 探讨左旋—二脱水伊地醇双甲磺酸酯(DMDAI-L)对HL-60细胞Bax蛋白表达的影响。方法 通过免疫细胞化学法和western blot分别测定不同剂量DMDAI-L对HL-60细胞的Bax蛋白的表达情况。结果 免疫细胞化学法定性实验结果显示药物干预后HL-60细胞Bax阳性表达高于正常对照组；western blot结果显示不同浓度药物（2.5mu;g/ml、5mu;g/ml、10mu;g/ml）干预HL-60细胞48h后，Bax蛋白相对表达(0.59plusmn;0.02、0.90plusmn;0.09、1.07plusmn;0.03)，正常对照组为（0.32plusmn;0.03）;各给药组与正常对照组比较均有统计学意义（plt;0.05）。结论 DMDAI-L诱导HL-60细胞凋亡过程中，其作用机制可能与上调Bax蛋白表达有关。 【关键词】 DMEDAI-L HL-60 免疫细胞化学法 western blot Bax 白血病是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，常表现为贫血、出血、感染和浸润等临床症状[1.2]，严重威胁着人类的生存和健康。化学治疗是肿瘤治疗的重要手段，目前大多数化疗药物都是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来抑制肿瘤细胞增殖的，但是，通过多年的临床研究发现多数抗肿瘤药物在临床应用过程中容易产生耐药性并有严重的不良反应，因此寻找高效低毒的新型抗肿瘤药物成为癌症治疗的当务之急。国内治疗白血病药物种类繁多，烷化剂类细胞抑制剂是近几年的研究热点之一。左旋-二脱水伊地醇双甲磺酸酯（DMDAI-L）属烷化剂类细胞抑制剂。韦焕英[3]对本品进行药效毒理学试验，实验表明，DMDAI-L不仅对多种实验性肿瘤有抑制作用，且对L1210淋巴细胞白血病也有明显的抑制作用。本课题组前期研究发现DMDAI-L对HL-60细胞增殖具有良好的抑制作用并且诱导HL-60细胞凋亡，使HL-60细胞周期阻滞于G1/G0期[4]。本研究拟观察DMDAI-L对HL-60细胞Bax蛋白表达的影响，为进一步阐明DMDAI-L抗肿瘤的作用机制提供理论依据。 1 材料与方法 1.1药品、试剂与仪器 DMDAI-L由广西中医药研究所刘元教授提供；人原髓细胞白血病细胞HL-60购自武汉博士德生物工程研究院；RPMI-1640培养基、胎牛血清（HyClone）；Bax鼠抗人多克隆抗体、GAPDH单克隆抗体、羊抗鼠二抗（均为Santa cruz,US），ECL发光剂（碧云天生物公司）。超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；CO2饱和湿度恒温箱（美国Forma scientificlnc公司）；倒置光学显微镜（日本Ｏlympus公司）；高速冷冻低温离心机（美国Ｔhermo scientific公司）。 1.2实验方法 1.2.1细胞培养与给药方法 HL-60细胞培养于含有10%灭活的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100mu;g/ml的链霉素、2mmol/L的左旋谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中,在含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每1～2天换液。取对数生长期HL-60细胞（1x106/ml）接种于六孔板中，每孔1.8ml，预培养12h后加入含药物培养基，每孔0.2ml，使孔中药物的终浓度依次为2.5mu;g/ml、5mu;g/ml、10mu;g/ml，另设正常对照孔，培养48h。 1.2.2免疫细胞化学 正常对照组和给药组处理48h，离心收集细胞，PBS洗2次，细胞涂片，室温晾干,4%的多聚甲醛固定30min，1%Triton X-100破膜10min, 3%过氧化氢的去离子水灭活内源性过氧化物酶活性15min,羊血清封闭20min，按SDAB试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，以PBS代替一抗作为阴性对照。苏木素复染，盐酸酒精分化，反蓝，脱水，透明，中性树胶封片，随机计数高倍镜下10个视野中的阳性细胞数和总细胞数，求出每组细胞的阳性率。 1.2.3 western blot检测Bax蛋白表达 各剂量组处理48h，1000rpm、5min离心收集细胞，用预冷的PBS洗2次，加预冷的胞浆总蛋白提取裂解液，冰上裂解30min，4℃、15000g离心15min，收集上清液。BCA法测定蛋白质含量，按照体积比4:1加入5times;SDS凝胶电泳上样缓冲液，1