中药材羚羊角及其伪品的鉴别.docVIP

精品论文 参考文献 中药材羚羊角及其伪品的鉴别 崔培燕 刘桐辉 （吉化集团公司总医院二院药剂科 吉林吉林 132022） 【中图分类号】R282.5 【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2013）19-0401-02 【摘要】 目的 通过PCR扩增法鉴别羚羊角的真伪。 方法 利用设计软件Primer5.0设计羚羊角线粒体DNA的特异引物，对羚羊角及其伪品进行特异扩增。结果 正品羚羊角能扩增出大小为310bp的条带，而伪品无条带。结论 通过PCR扩增后主条带与羚羊角扩增的条带大小和亮度一致，则为正品；如不一致，则为羚羊角的混淆品。这种方法对于鉴别名贵中药材，具有广阔的应用前景，以确保患者的用药安全。 【关键词】 羚羊角 特异性引物 PCR 羚羊角始载于《神农本草经》，列为中品。具有平肝息风，清肝明目，散血解毒之效。由于羚羊角含有丰富的化学成分，药理作用非常明显，是我国传统名贵的中药材。但是目前市售的商品多数为加工的羚羊角产品，以假乱真的现象非常严重[1]- [6]。这不仅影响传统药学的发展，还给消费者用药带来很大的安全隐患。因此提供简便的鉴别方法来鉴别羚羊角具有深远的意义。本文对羚羊角的微量DNA进行特异引物扩增，达到鉴别羚羊角真伪的目的。 1 材料与方法 1.1 药材 羚羊角（吉林市食品药品检验所提供并鉴定）、市售羚羊角:N1-N7（吉林市中药材市场随机购买）。 1.2 试剂 提取液[10mmolbull;L-1 Tris-Cl (pH=7.6)、10mmolbull;L-1 Na2EDTA,60mmolbull;L-1 NaCl]、蛋白酶K（30mgbull;ml-1）、SDS（10%）、Taq DNA Polymerase（1000U）、游离脱氧核苷三磷酸dNTPs、琼脂糖凝胶粉。其它化学试剂均为分析纯。无菌双蒸水（自制）。 2 方法 2.1羚羊角DNA的提取 羚羊角首先用70%的酒精浸泡5min，然后用37℃烘箱烘干，研磨成细粉，称取0.3g细粉放入离心管中，加入裂解液600micro;l，蛋白酶 K 20micro;l、SDS40micro;l，56℃水浴震荡过夜。次日取出加入600micro;l饱和乙酸钠，12000rbull;min-1离心10min,取上清加异丙醇，混匀，-20℃放置1h。12000rbull;min-1离心10min,弃去上清，然后加入70%乙醇抽提两次，无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存。 2.2 DNA琼脂糖凝胶检测 将DNA样品利用0.7%琼脂糖凝胶检测,电压90V,电泳40 min。（图1） 2.3引物设计及PCR扩增反应 从GenBank中查寻羚羊角线粒体DNA细胞色素b的基因序列，采用Primer 5.0进行设计，引物序列为： 上游引物：5rsquo;TACAACCCAACAGGATTC 3rsquo; 下游引物：3rsquo;CGCTGAATGGTCGGAATA 5rsquo; PCR反应体系为: DNA模板2micro;l、10times;PCR buffer 3micro;l、dNTPs 2.4micro;l、上游引物1micro;l、下游引物1micro;l、Tap DNA聚合酶1micro;l，加水补足30micro;l。循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸30s,30个循环后72℃延伸15min，4℃保存。 2.4 PCR产物检测 将PCR产物利用2%琼脂糖凝胶检测，电压90V，电泳40 min，利用紫外凝胶成像系统拍照。（图2） 3 结果 3.1 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱 将提取的各样品的线粒体DNA利用0.7%琼脂糖凝胶检测，分子量约为22 000bp，结果见图1。 图1 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱 （M：Marker；1：羚羊角; N1-N7：市售羚羊角） 3.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱 PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶检测，正品羚羊角能扩增出310bp的片段，市售羚羊角只有两个显示和正品一样的条带，其它样品无条带，结果见图2。 图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱 （M：Marker；1：羚羊角; N1-N7：市售羚羊角） 4. 讨论