SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.pptVIP

SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质 原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两类。圆盘电泳和板状电泳原理相同。 不连续体系 组成:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 凝胶孔径不连续性 在2层凝胶中样品/浓缩胶为大孔径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢，因而在两种胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 电位梯度的不连续性 在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，就会很快超过被分离物，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的区域，这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时，建立一种稳定状态，这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面，这就是样品被浓缩的中间层。压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。 （1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中，前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)，尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应 A为电泳前3层凝胶(均有快离子和慢离子)排列顺序B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 不连续系统浓缩效应示意图 SDS蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 十二烷基磺酸钠(SDS)在可以结合大量的蛋白质分子（1克蛋白结合1.4克SDS），这种带有相同密度的负电荷的SDS-蛋白质复合物，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，从而掩盖了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；由于蛋白质结合SDS后，蛋白质的构象发生了改变，SDS-蛋白质在水溶液中近似长椭圆状，不同复合物短轴一样约为18埃，而长轴随蛋白质分子量成正比变化。因此在进行电泳时，蛋白质的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。 三、试剂与器材 1 10%SDS; 2 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis); 3 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）; 4 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）; 5 10%过硫酸铵; 6 10%TEMED; 7 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液; 8 1%琼脂糖溶液; 9 0.05％考马斯亮兰R250; 10 7%醋酸 五 操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已