讲文献(博士论文).pptVIP

结果分析： 肽段一：其结构特征符合两亲结构特点，即抗菌肽分子中疏水氨基酸残基和带正电荷的碱性氨基酸残基分别集中分布于分子的特定区域，为其微生物抗性机制提供了结构基础，抗菌肽碱性氨基酸残基集中的带正电荷区域通过与微生物细胞膜表面带负电荷区域相互作用，最终导致细胞膜通透性发生改变。 肽段二：序列中富含P，具有抗菌肽的一些典型特征。 肽段三：中含有6个C，可形成二硫键和β折叠结构，具有抗菌肽的典型特征。 肽段四：净电荷为负，几乎不可能是抗菌肽。 杜仲皮中的蛋白肽片段在抗菌肽数据库中序列比对结果 这三个肽片段都与抗菌肽数据库中的抗菌肽具有一定序列同源性， 这些抗菌肽主要来自两栖类、昆虫和植物，除抑制革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌外，有的还能抑制真菌生长。 结论：经序列比对、同源性分析、抗菌功能预测，再结合抗菌活性分析，将含有肽片段-LYQQLIAGITLNK-的蛋白命名为EAFP3，即是从杜仲中分离到的第三个具有抗真菌活性的杜仲抗真菌蛋白。EAFP3是一个新的杜仲(皮)抗真菌蛋白． 杜仲胶颗粒结合蛋白肽片段抗菌预测结果如图 预测结论：抗菌肽特征；正电荷、两亲性螺旋结构、有的抗菌肽富含某种特殊氨基酸(如P、G、W)，据结构特征判断，-LPVAVKTGAEVVYSK-，-TNGPVVNLKAFLKK-和-GRSAPVLAATVAGDTR-三个肽片段最有可能是抗菌肽。 具备抗菌肽结构特征的8个肽片段在抗菌肽数据库中进行同源序列比对结果图。（杜仲胶颗粒结合蛋白） 由图可得：8个肽片段均与抗Gram+和Gram-的肽片段具同源性，其中有三个肽段与抗真菌肽有一定的同源性。这些肽片段可能参与了植物防御和胁迫等过程。 蛋白抗菌活性研究： 细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、都柏林沙门氏菌。 真菌：白色念珠球菌ATCCl507、酿酒酵母ATCCl 403、木霉、青霉、根霉、米曲霉、曲霉、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病、玉米大斑病菌、小麦赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、番茄灰霉病菌、马铃薯晚疫病菌、黄花菜链格孢病菌 、茶轮斑病菌。 营养琼脂培养基（细菌）马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（真菌） 根据表格分别用20 mmol/L的磷酸盐缓冲液配成溶液 滤纸片法：。取10ul不同浓度的液滴到直径6 mm的灭菌滤纸片上，金黄色葡萄球菌用青霉素作阳性对照，大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌和都柏林沙门氏菌用链霉素作阳性对照。 20 mmol／L的磷酸盐缓冲液作阴性对照。 （细菌、白色念珠球菌和酿酒酵母在37 ℃振荡培养12 h，霉菌培养24 h，植物病原真茵培养48 h，） 用咪康唑作为抗真菌抑制剂阳性对照，磷酸盐缓冲液作阴性对照（真菌）培养96h后，测抑菌圈直径。 抑菌活性(％)=蛋白抑菌圈直径Dp(mm)/阳性对照抑菌圈直径Dc(mm)×100％ W抑菌环宽度：W3 mm强抑菌，W2．5 mm显著抑菌，1mmW2．5mm抑菌，W0．9mm弱或无抑菌活性 * 博士学位论文 题目：杜仲蛋白纯化、序列分析及抗菌活 性研究 姓名：刘世会 指导教师：赵德刚 2008年6月1号 摘要 实验项目：1.杜仲皮和杜仲胶颗粒中蛋白的分离纯化 2.序列分析 3.体外抗菌活性研究， 实验方法: 1.凝胶层析、反相高效色谱层析, SDS.用液相色谱质谱联用(LC-MS／MS)技术，鉴定了不同分子大小的蛋白序列. 3.用纸片法对EAFP3进行体外抗菌活性检测 实验结果: 1.分离到分子量为4.16的一个新杜仲抗真菌蛋白,杜仲胶颗粒中分离到分子量约为14、16、18、22、24、28、30、32和55 kDa的9个杜仲胶颗粒结合蛋白。 2. 用液相色谱质谱联用(LC-MS／MS)技术，鉴定了4.16、4.2、8.3、16和18 kDa蛋白序列，获得14个肽片段，在抗菌肽数据库(APD)对这14个肽片段进行结构分析、抗菌活性预测和序列比对，结果显示有11个肽片段具有抗菌肽典型结构. 3. EAFP3可抑制酵母、酵母类真菌、霉菌和植物病原真菌的生长，EAFP3对白色念珠球菌、黄曲霉、番茄灰霉病菌的lC50值分别为31．25，31．25和62．5 ug／mL. EAFP3对高温有一定耐受性，在100℃加热30 min仍有显著抑制活性；可适应较宽pH范围，在pH从5．8—8．0范围内都有显著抑制活性。 技术路线：提取总蛋白（捣碎—过滤—离心—NH4SO4分级沉淀—透析—离心） 凝胶层析（18ml/h流速）