我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测(1)研究.pdfVIP

750囝2004学术年会 我国自然发病鸡群中MDV、REV 和CAV共感染的检测+ 姜世金1，田夫林2，崔治中1，孟姗姗1，王增福1 摘要：从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾1l省42个 不同鸡群收集临床有发病表现的792只病、死鸡的病理组织样品，用点杂交方法检测各个样品中马 了这三种病毒在我国的广泛分布及其在生产鸡群中的混合感染是导致当前我国养禽业生产性能下 降、条件致病性疾病发生严重、临床腺胃肿大症状发生的重要原因。 共感染 近年来我国出现了一种临床上以病死鸡消瘦或高度消瘦为主要I临床特征的传染病，解剖这 种自然发病鸡常可见到各种脏器的肿瘤变化，胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官的明显肿大或萎 缩。也有很大一部分发病鸡仅表现为轻度消瘦，腺胃轻度肿胀或无明显异常，其它组织器官也 未发现明显病变，但其生产性能明显下降，常规疫苗免疫效果不佳，给养禽业生产带来了巨大 损失。 针对上述I临床症状和病理变化，自2000年以来我们采用核酸探针杂交技术对来自全国包括台湾 病学调查，以获得国内免疫抑制病分布状况的第一手资料，为指导生产提供理论依据。 1材料和方法 1．1病料的收集与处理 从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾11省42个不同鸡群收集 临床有发病表现的828只病、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、腺胃、法氏囊或羽毛囊等。对组织 样品，各取0．19研磨(如果是羽毛样品，则剪取12根羽毛囊根，每根若长2mm)，加入O．5mlDNA抽提 NaCI，10mMTfis-Cl EDTA 缓冲液(100frlM PH8．0，0．25mM u曲nl的 pH8．0，0．5％SDS)和终浓度为100 蛋白酶K，55。C消化过夜。次日，按常规方法提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液中，即为样品DNA。 同时提取SPF鸡(由山东济南斯帕法斯SPF鸡场提供)相应组织的DNA作阴性对照。 +基金项目：国家自然科学基金重点项目( 作者简介：姜世金(1971一)，男，山东莱阳人，博士，副教授，主要从事动物免疫学与病毒分子生物学研究。 E—mail：s．i3iang@sdau．edu．cn 2004学术年会 1．2探针的标记 I系MDV SNV株全基 Mdll株pp38基因的特异性片段PCR产物用于标记MDV探针；REV 因组cDNA克隆用于标记REV探针：CAVCux．1株全基因组DNA克隆用于标记CAV探针。 溶于15uI去离子水中，然后按以下步骤进行探针标记：模板DNA在1004C水浴煮10min，使模板 DNA变性，立即置于．20℃保存的冰冻乙醇中冷却5min；离心后将变性的模板DNA定容至15．Oul， 0ul 然后加入20ul六核苷酸引物，2dNTP标记混合液，1．0ulKlenow片断，37℃水浴20h以上；加 入2．0ul0,2M 5ul4MLiCl和75 h EDTA(pH8．0)终止反应；加入2 ul无水乙醇，充分混合；置一20℃2 ul幢 Buffer(pH8．O)中，．20℃保存备用。 1．3应用斑点杂交法对MDV、CAV、REV进行检测 1．3．1 DNA舍■的测定 取一定量板(1％琼脂糖凝胶+适量溴化乙锭)，用DL2000Marker倍比递进稀释作对照，各取样1 uL点板，吸收后，用凝胶成像系统根据亮度判定样品DNA含量。所有样品中DNA含量均大于每 微升0．2ug。 1．3．2点样 将3张适当大小硝酸纤维素膜(NC膜)作好标记，取样品在3张膜上各点lul。已知含有MDV、 然后在80℃烤2