HSP-FLP重组质粒的构建及表达分析.pdfVIP

第 33卷 第 5期 怀化学院学报 Vo1．33．No．5 2014年 5月 JOURNALOFHUAIHUA UNIVERSITY MaY．2014 HSP—FLP重组质粒的构建及表达分析 屈永贵， 陈婷芳， 王 静 ， 王飞英 ， 吴秀山， 邓 云 (湖南师范大学 生命科学学院， 湖南 长沙 410081) 摘 要 ：为 了制备用于在斑马鱼 中热休克全身表达 目的基 因的转基 因载体 ，通过分子克隆的方法从 P {hsFLP} 86E／TM6B转基 因果蝇的基 因组 中克隆出FLP．并 同时对 HSP—Wnt5A—EGFP栽体进行改造 ，Wnt5A由FLP代 替，并在 FLP和 EGFP编码 区之 问插入带有多克隆位点的 IRES序列，获得 pTol2一HSP—FLP—IRES—EGFP转基 因表达载体 ．利 用得到的转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎 中进行表达分析，结果表明，经热激外源 目的基因FLP和报告 基 因EGFP均能在斑马鱼 中表达 ．pTo12一HSP—FIJP—IRES—EGFP转基 因表达载体 的成功构建对于建立 FIJP，FRT重组 系统 的斑马鱼转基 因实验模 型具有重要意义 ． 关键词 ：HSP； FLP； 斑马鱼 ； 转基 因 中图分类号：Q341 文献标识码 ：A 文章编号：1671—9743 (2014)5—0033—04 斑马鱼具有繁殖能力强 ，体外受精和发育，性成 鱼 ．通过 FLP／FRT位点特异性重组系统构建转基因斑马 熟周期短，个体小易养殖 ，后代繁育数量大，光透性 鱼 品系 ，让研究者们能够像在小 鼠和植物 中那样设计 的胚胎，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点， 一 些更加简洁地斑马鱼条件敲除实验 ． 使其成为后基 因组时代生命科学研究 中重要 的模式脊 1 材料与方法 椎动物之一[． 随着分子生物学技术不断地发展 ，基 因完全敲除、 1．1 材料 基 因条件敲除、基 因插入 、点突变 、缺失突变 、染色 pTol2一Cmlc2一ires—EGFP、HSP—Wnt5A—GFP质 体组大片段删 除等基 因工程技术也随之而生 ．像位点 粒 以及大肠杆菌 DH5a菌株为湖南师范大学心脏发育研 特异重组属于一种基因条件敲除，位点特异重组是 由 究中心一80~C保存 ．质粒小提试剂盒 、去 内毒素质粒 位点 特异重 组酶介 导 的 DNA重组 反应 ，Cre／loxp和 小提试剂盒 、胶 回收试剂盒购 自OMEGA公司，pMD18 FLP／FRT系统是研究最为详细 的两个重组酶系统 ，并 一 T载体 、DNA连接试剂盒 、ExTaqDNA 聚合酶购 自 且越来越广泛 的应用于基 因的调控和条件敲除_2J．这 TaKaRa公司，各种 限制性 内切酶购 自Fermentas公司， 两个系统具备无启动子 限制 、无 明显底物偏好 、基 因 大肠 杆菌 OneShotecdBSurvivalCompetentCells购 自 调控效果稳定等优点l3J．FLP／FRT位点特异性重组系统 Invitrogen公 司，一80℃保存 ．斑 马鱼独立 养殖系统 由于具有比Cre／loxp系统更高的重组效率和靶向性 ，已 (北京爱生)、显微注射仪 (HARVARDAPPARATUS)． 经被广泛应 用于细菌、HIV病毒等微生物和拟南芥、 1．2 方 法 水稻、小鼠、大 鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物 1．2．1 pTol2一HSP—FLP—ires—EGFP表达载体的构建 的研究中，实现 了基 因条件敲除、基 因插入 、点突变 、 首先挑 50个 P {hsFLP}86E／TM6B转基因果蝇胚 缺失突变