第三章 细胞污染的检测与排除.pptVIP

第三章 细胞培养的污染和排除 细胞培养技术 细胞污染: 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。 污染 微生物的污染 不同细胞类型的交叉污染 细菌 霉菌 支原体 化学物质污染 病毒 污染途径： 　１．空气: 培养设施不宜置于通风场所； 定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞； 　操作中应减少空气流动；带口罩； 　夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～5个。 ２．清洗消毒 培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。 ３．操作 实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。 ４．血清 血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。 ５．组织 初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染 污染对细胞的影响 在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。 当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。 1．细菌污染： 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。 细菌污染后大多能改变培养液pH使培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。 加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。 2．真菌污染： 真菌种类繁多，形态各异，在霉雨季节更易污染。 真菌污染后，培养液一般不发生混浊，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。 ３．支原体污染 支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。 支原体一般过滤除菌无法去除，开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见。 细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化， 4.病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 5.非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是HeLa细胞。 真菌感染 支原体污染 电镜照... 细菌污染 扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体 污染的预防和排除 重在预防，排除困难！ 1．抗生素排除法： 一些有价值的细胞被污染后，可采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48小时，再换入常规培养液。有时可能奏效。 2.加温除菌 (用于清除支原体） 根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41℃中作用5～10小时(最长可达18小时)以杀灭支原体。但41℃对培养细胞本身也有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 3.动物体内接种 　受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出再进行培养繁殖。 4.与巨噬细胞共培养 　巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将其消化。利用96孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。 课后思考题： 1.细胞培养中污染主要通过哪些途径？ 2.细胞培养中常见有哪些微生物污染，如何排除细胞污染？