4 单克隆抗体.ppt

第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 第一节 杂交瘤技术的基本原理 HAT培养基?  HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de?novo?pathway）和中间合成途径（salvage?pa-thway）。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。 次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。 ? 制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine?H，氨基喋呤Aminoopterin?A及胸腺嘧啶核苷Thymidine?T），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。? 单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②?可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。 第三节 基因工程抗体制备 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。 第四节 单克隆抗体的应用 用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 （一）基本原理和程序 噬菌体抗体库 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 （二）噬菌体抗体库技术的特点 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用 抗体库技术的应用和前景 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 效率最高 价格昂贵 FACS 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步