遗传标记-PCR原理与应用.ppt

PCR技术的原理与应用 PCR技术的产生 PCR技术的原理 PCR原理类似于DNA的体内复制。 PCR的原理 特异性强：引物与模板DNA按照碱基互补配对原则结合，耐热DNA聚合酶使整个反应可在较高温度下进行，结合的特异性大大提高。 灵敏度高：理论上可从100万个细胞中检测出1个靶细胞 简便迅速：一个PCR反应约需要2～4小时，扩增产物可直接电泳分析，直观、便捷。 对模板要求低：不需特殊方法分离病毒、细菌或培养细胞，DNA粗制品即可作为扩增的模板 平台效应 “平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。 PCR反应成分 DNA聚合酶 dNTPs 模板 引物 PCR反应系统的组成 10×扩增缓冲液 　 10ul　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　　　　 模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　　　　 加双或三蒸水至 　 100ul 10×扩增缓冲液的成分通常含有适量的KCl, MgCl2, Tris-HCl。Tris缓冲液是一种双极化离子缓冲液，它能有效地调节pH，使其维持在DNA聚合酶活性所要求的偏碱性环境；镁离子是DNA聚合酶的活性所必须的，它既影响到反应的扩增效率，也影响反应的特异性，过量的镁离子常常引起非特异性扩增反应；KCl的作用是促进引物退火。 PCR反应中的模板可以是来源于任何生物的单链及双链DNA。PCR对模板纯度要求不高。样品中存在一定量的蛋白质或有机物对实验结果影响不大，甚至可以将细胞裂解物直接用于扩增，有DNA部分降解的样品，也可以作为模板使用。但是样品中不能含有某种可抑制DNA聚合酶活性的杂质。 PCR反应中，起始模板的用量，理论上讲可以少到仅有一个有效的单一分子。为了获得高质量和高效率的扩增，模板用量可为纳克或微克水平。 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列 这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性 引物长度：15－40bp，常用为２０bp左右 引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 引物的碱基尽可能随机发布 避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40％－６０％之间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 引物内部应避免形成二级结构 特别是引物的末端应避免有回文结构。 二个引物不应有互补序列 特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚 体”，浪费引物。 引物5’末端碱基无严格限制 在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。 引物扩增跨度 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 PCR扩增条件 试验者应根据自己的引物Tm值及实验目的进行设定退火温度，退火时间选择范围是３０秒到１分钟。延伸温度通常变化不大，延伸时间应该根据欲扩增的靶序列的长度进行调整，一般按每分钟合成１０００个碱基的速率来计算， PCR扩增产物分析 分析PCR扩增产物的最常用方法是凝胶电泳分析法。 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 凝胶电泳分析包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度高，但操作复杂。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。 核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基团带有负电荷，因此当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。在凝胶浓度和电场强度一定的情况下，DNA分子的这种迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移快，双链环状DNA比同等分子量的松散