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20-实验三 食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法) 实验三 食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法） （5009．5-2003食品中蛋白质含量测定） 一、目的与要求 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 三、仪器与试剂 （一）试剂 1、硫酸铜（CuSO4·5H20） 2、硫酸钾 3、硫酸（密度为1.8419g/L） 4、硼酸溶液（20g/L） 5、氢氧化钠溶液（400g/L） 6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。 7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 8、黄豆粉。 （二）仪器 微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。 图3- 微量凯氏定氮装置 　　　　　1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a； 　　　　　4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层； 　　　　　7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。 四、实验步骤 1、样品消化 称取黄豆粉约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤 　　检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 　　测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。 3、碱化蒸馏 量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。 同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。 4、样品滴定 以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。 5、数据记录 项 目 第一次 第二次 第三次 样品消化液（mL） 滴定消耗盐酸标准溶液（mL） 消耗盐酸标准溶液平均值（mL） 五、结果计算 　　　　　　　 　　　　　　　式中 X--样品蛋白质含量（g/100g）； 　　　　　　　　　　　V1--样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）； 　　　　V2--空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）； 　　　　c--盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）； 　　　0.0140 --1.0mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量（g）； 　　　　m--样品的质量（g）； 　　　　F--氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70； 高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。 　　　　计算结果保留三位有效数字。 六、注意事项及说明 1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~