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培养局的纯培养 实验六 微生物的纯培养 一、目的与要求 1. 学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。 2. 用平板划线法和稀释法分离微生物。 3. 了解四大类微生物的培养条件和培养时间。 3. 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。 二、实验原理 纯培养技术是实验室中最基本的操作技术，由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用的接种方法不同，都是为获得良好的纯种微生物，为此，接种通常都应在空气经过消毒的“无菌室”或接种箱内进行，同时因接种方法不同，常采用不同的接种工具。微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。 纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯化（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 微生物的分离与纯化常用方法有： 1.简易单细胞挑取法 单细胞挑取法可以直接得到纯培养。它需要特制的显微操纵器来分离单细胞，或直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。 2.平板分离法 稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。 该方法操作简便，普遍用于微生物的分离和纯化，其原理包括两方面： （1）选择适合于目标微生物生长的条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 （2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养，可通过稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线等技术实现。 但从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。还应结合菌落特征、显微镜检测个体形态特征，甚至要经过多次的分离与纯化过程和多种特征鉴定才能获得。 微生物分离纯化的一般流程图如下： 三、实验材料 1. 所需仪器：净化工作台、微波炉、酒精灯等 2. 所需耗材：各小组自行选择微生物来源，如土壤、污水等。 6套无菌培养皿、250ml三角瓶（一个装45mL无菌水，一个装100ml固体培养基）、4支无菌1ml刻度吸管吸管、3支装有9mL无菌水的试管、6支装10ml牛肉膏蛋白胨培养基搁置斜面、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。 灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100 ml。 四、实验步骤 1. 倒平板 培养基加热溶化，待冷至55-60℃后，取灭菌后的培养皿，右手持盛有培养基的三角瓶在火焰旁边，左手将瓶塞轻轻地拔出，将瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（若培养基一次用完，瓶塞可不必夹在手中）。左手拿培养皿，并将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻晃动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面，待凝固后即为平板。在无菌培养皿底部注明稀释度、组别、班级等。 2. 制备稀释液 （1）取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。 （2）另取装有9mL无菌水试管3支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4。取已稀释成10-1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-3、10-4土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管。 3. 平板分离 （1）稀释涂平板法（不做） 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 （2）稀释混合平板法（混菌法） 取一吸管，以无菌操作法吸取10-3、10-4土壤稀释液1mL，加在空培养皿中，再倒入适量15~20ml冷却好的培养基，水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养，用于稀释混合平板法分离及平板菌落计数实验。 （3）稀释平板划线法 用接种环取相应的菌液（10-2）一环在平板上划线。 a.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。 b.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约60。角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。 4. 培养 平板倒置于37℃培养箱，培养48h。