体外分析技术-核医学教学.docVIP

体外分析技术 一、概论 体外标记免疫分析是当今先进的超微量检测技术，它的测量值可精确到毫微克（ng）—微微克（pg），甚至达毫微微克级（fg），它的基础是先进的放射性或非放射性标记技术和先进的抗原—抗体结合的免疫技术。它主要被用于检测人体的各种激素和各种肿瘤标志物。是当前的重要检测技术之一。 体外标记免疫分析技术起始于1959年，由美国的Berson和Yalow共同建立了放射免疫分析法（RIA），由于RIA具有灵敏度高、特异性强、重复性好、测量简便、成本低等优点。在生物学和医学中对机体超微量活性物质的分析取得重要突破而获得飞速的发展，故Yalow在1977年获得诺贝尔奖。 但因RIA法必须使用放射性物质，所以在发展中受到一定限制。自70年代起科学家们曾先后研究并建立了多种非放射性物质的标记免疫分析，如酶标记免疫分析（EIA）、时间分辨荧光分析（TRFIA)、酶放大发光分析（CLEIA）、化学放光（CLIA）、电化学发光（ECLRA）等，并且可进行仪器的全自动化测定和全自动的数据分析。 各种测定方法主要是标记技术、标记品的不同而采用的测量方法不同，各具特点和优点，其基本原理还是标记免疫技术，其中最基本的还是放射免疫分析和免疫放射分析。 二、放射免疫分析的基本原理 放射免疫分析法（Radioimmunoassay,RIA）是建立在放射性分析的高度灵敏性与免疫反应高度特异性基础之上的超微量分析技术。通过测定放射性标记抗原—抗体复合物的量来计算出待测抗原（样品）的量。20世纪50年代末Berson和Yalow在研究胰岛素抗体时，首先了建立放射免疫分析法定量测定胰岛素含量，从而开创了生物活性物质微量测定分析的新时代，从此放射免疫分析技术以其灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等优点而独树一帜。目前应用放射免疫分析技术能测定生物活性物质达300余种，被广泛应用于生物学医学各个领域。 放射免疫分析法的基本原理是竞争性抑制反应。设定限量的特异性抗体（Ab）与一定量的特异性标记抗原（*Ag）在一定条件下发生免疫反应，形成标记抗原—抗体复合物（*AgAb）。如在上述反应体系中加入非标记的抗原（Ag），则非标记抗原和标记抗原与限量抗体间发生了竞争性结合的抑制反应。当反应平衡后，将反应体系中的标记抗原—抗体复合物（B）与游离的标记抗原（F）分离，测定标记抗原-抗体复合物的放射性（每分钟计数cpm），通过计算，求出非标记抗原的量（图1） Ag + Ab AgAb + Ag + *Ag *Ag+ *AgAb 图1 放射免疫分析法的基本原理 可以看到，在反应体系中由于标记抗原和抗体都是限量的，随着投入的非标记抗原量的增大，标记抗原和抗体的结合量被抑制降低，此即为“竞争性抑制反应”。在实际应用时，用一组不同浓度的标准品抗原，在相同条件下，和标记抗原与抗体发生竞争性反应，随着标准品量的逐步增大，标记抗原-抗体结合率则逐步降低（图2），以标准品抗原浓度作为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合率（B%）作为纵坐标，绘制标准曲线，测量待测样品的标记抗原-抗体复合物的放射性结合率（B%），即可自标准曲线上查得被测样品相应的含量。 标准品抗原浓度 图2 放射免疫分析法的标准曲线 三、免疫放射分析的基本原理 免疫放射分析（Immunoradiometric assay ,IRMA）于1968年由Miles和Hales所建立，它是利用放射性125I标记抗体作为示踪剂与非标记抗原（标准品或待测样品）形成复合物后，弃去多余的游离的标记抗体，测量抗原-标记抗体复合物的放射性，绘制标准曲线，测量所得的复合物的放射性和非标记的抗原量成正相关。由于反应体系中使用过量的抗体，故灵敏度比放射免疫分析有明显提高，且标准曲线的测量范围也明显扩大。 免疫放射法的主要特点是：1.属于非竞争性抗原抗体结合反应2.抗原-抗体复合物的量与所测非标记抗原的量成正比 3.免疫放射分析法的非特异性结合对低剂量区的影响很大，因此对分离条件的要求特别严格。 虽然免疫放射分析有着诸多优点且也早已建立方法，但直至八十年代单克隆抗体技术推广之后，才被广泛的应用，这是因为免疫放射分析需要大量的标记抗体之故。 四、放射免疫分析和免疫放射分析的比较 此两者分析技术的比较见表1 表1 放射免疫分析和免疫放射分析的比较 放射免疫分析 免疫放射分析 标记物 抗原 抗体 原理 竞争性抑制反应 非竞争性结合反应 抗体 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 五、标记免疫分析的构成条件 放射免疫分析其基本的构成条件有四，即抗体、标记抗原、标准品（抗原）和分离剂（方法）而