猪繁殖与呼吸综合征病毒重庆株的分离鉴定研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 猪繁殖与呼吸综合征病毒重庆株的分离鉴定 周婷 曾三杰文心田 肖驰 14)) (四川农业大学动物科技学院基因芯片实验室动物疫病与人类健康四川省重点实验室雅安6250 摘要：从重庆某猪场的发病仔猪中分离到一株病毒，命名为C14—2。该病毒能在Marc．145细胞上增殖并致 细胞病变；电镜观察可见病毒粒子呈球形，有囊膜，直径大小为40．60nm；核酸类型为RNA病毒：不凝 为病毒培养的最佳PH值；经病毒中和实验、RT-PCR鉴定以及动物回归实验表明该分离毒为美洲型猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒：分离：鉴定 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRSV引起的猪的生殖和呼吸系统综合征．该病以母猪发热、厌食、 流产、死产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征…。目前PRRS已呈世 角度证明了PRRS在重庆地区存在，为调查分析PRRS在我国的流行情况、基冈分型等奠定了基础。 l材料和方法 1．1材料，。 ， 1．1．1细胞：Marc．145、BHK21、Vero、IBRS细胞(四川农业大学基因芯片实验室提供) 1．1．2美洲型弱毒疫苗株。西班牙弱毒疫苗株 1．1．3营养液：1640(购自GIBCO公司)小牛血清：(购自HyCIone公司) 1．1．4 PRRSV美洲型血清：INDEXX公司提供 1．1．5主要试剂及试剂盒：小量组织／细胞总RNA快速抽提纯化试剂盒(购自上海华舜生物公司)；One Step RNAPCR Kit(AMV)(购自大连宝生物公司)。 1．2方法 1．2．1病料采集及处理 对重庆市某猪场初步诊断为猪繁殖与呼吸综合症的仔猪病例进行病理剖检，无菌采集肺脏、脾脏、淋 3000r／min钟离心10min，取上清液进行过滤，收集滤液为病毒分离材料样品，一20℃保存各用。 1．2．2病毒分离培养 收毒，未出现CPE传5代判为阴性。 1．2．3电镜形态观察 间段的细胞，按常规消化制备超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，电镜观察。 1．2．4 TCIDso的测定 将病毒作10倍系列稀释，大致推测估计病毒的毒价，选择5．8个病毒稀释度接种到K单层细胞的96 孔培养板，按Reed．Muench方法计算【3J。 1．2．5分离毒理化特性测定 参j{cl文献【5】进行病毒核酸类型的鉴定、病毒血凝特性测定、温度对病毒的稳定性的影响和不同PH值 19l 荨f}传染病 对病毒滴度的影响。 1．2．6病毒中和试验 按参考文献[5】采用固定病毒．稀释血清法在96孔细胞培养板上进行。将200TCID50的分离毒与等量的 观察。按Reed．Munech方法计算50％血清中和终点。 1．2．7分离毒的RT-PCR鉴定 引物：根据已知北美洲株ATCC GCTTGCCGTTGT37。 病毒基因组总RNA的提取：按小量病毒RNA／DNA抽提试剂盒说明提取。 10xone RNAPCRBuffer RT-PCR反应体系： step 5．09i； 1 0mmol／LdNTPMixture Reverse 1．Opl：AMV 0．0pl；1 5．0pl；AMV-Optimizedtag Rnase free