探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用.docVIP

精品论文 参考文献 探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用 黑龙江省传染病防治院 150518 【摘 要】目的：研究分析从人血清提取 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被进行抗原检测，并讨论结核病诊断新方法。方法：利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68，建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接 ELISA 检测方法，并与 PPD-ELISA 同时检测 220 例结核病人血清、30 例非结核呼吸疾病病人血清和 50 例健康人群血清，分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果：ESAT6-ELISA 的敏感性为 25%，特异性为 95%；CFP10-ESAT6-ELISA 的敏感性为 45%，特异性为 93%；ESAT6-PPE68-ELISA 的敏感性为 48%，特异性为 85%。结论：三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于 PPD-ELISA，但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于 PPD-ELISA，其中 CFP10-ESAT6-ELISA 检测的效果最佳，PPE68 可作为结核特异性诊断的候选抗原。 【关键词】结核分枝杆菌；ESAT6；CFP10；PPE68；ELISA 结核病作为一种慢性传染性疾病，近年来发病率有上升趋势，临床上认为结核分枝杆菌引发呼吸道慢性传染是结核病发病的根源，由于其较高的感染率与耐药性，因此结核病的快速诊断对于结核防治有着重要的作用，但至今尚没有一种准确、快速、可靠的检测结核分枝杆菌感染的方法。结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的复杂蛋白物质，含有多种抗原成分，其最大的弱点是 PPD所包含的抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（bacillus calmette guerin，BCG）所共有[1]，故阳性结果也不能区分是致病性分枝杆菌还是非致病性分枝杆菌感，染抑或是接种 BCG 免疫的结果，大大减低了检测的特异性。因此本实验以 PPD 为参考，在建立 PPD-ELISA 的基础上，以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 为抗原，并对三种特异性抗体 ELISA 检测方法在对结核病的诊断效果进行了比较和评估。 1 材料与方法 1.1 抗原与主要试剂 纯化重组蛋白 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 由本室前期制备，结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）由贵阳市疾病预防控制中心提供。 主要试剂：牛血清白蛋白（BSA）由上海生工公司提供；脱脂乳（MILK）为雀巢公司产品；HRP 标记的羊抗人IgG 及 DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；96 孔酶标板为德国 Greiner 公司产品；ELISA 相关溶液由实验室自己配制。 1.2结核病参考血清和临床待检血清 结核病参考血清和临床待检血清由贵阳疾病预防控制中心提供。临床待检血清中 220 例为痰涂片染色镜检阳性、临床及 X 线诊断为肺结核的结核病人血清，其中男 148 例，女 72 例，年龄 14～78 岁。30 例非结核呼吸疾病病人（肺炎、急慢性支气管炎、肺癌）血清由我院呼吸科提供。 1.3方法 1.3.1 PPD-ELISA 最佳反应条件的确立 抗原 PPD 按 1∶400包被，即 42 mu;g / ml，放置 4℃过夜，取出洗涤 5 次，每次5 min 后，每孔加入 200 mu;l 1.0%BSA 封闭液，37℃封闭 1 h。血清样本用 PBST 按 1∶40 稀释，100 mu;l / 孔，37℃反 应 1 h后，洗涤 5 次。加入 1∶2000 稀释的 HRP 标记的羊抗人IgG100 mu;l / 孔，37℃反应 30 min，洗涤 5 次，最后拍干，每孔加入 DAB 底物液 100 mu;l，室温避光反应 10 min，最后加入50 mu;l 2 mol / L H2SO4终止反应，用酶标仪在 490 nm 波长下测定 吸光度 A 值。PPD-ELISA 阴 阳界 限的确 定：PPD-ELISA 检测 80 份健康人群血清，计算样品 / 阴性（S / N）平均值为 1.55，SD 为 0.32，求得临界 S/N=X+2SD=2.19，临界吸光度 A 值为 Ntimes;2.19，当 Nlt;0.05 时以 0.05 计算。 1.3.2 结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测方法的建立 分别以结核分