石蜡切片制备及免疫组化操作步骤.doc

石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一） （一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗） 1用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷 2将器皿在自来水下冲洗干净 3将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干 注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。 （二）硫酸洗液的配制 称取5g重铬酸钾粉末，置于250ml烧杯中，加mL水使其溶解，然后慢慢加入100mL浓硫酸，溶液温度将达80，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。（三）载玻片与盖玻片的处理 1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入中浸泡24小时 2.流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍 3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用 二、准备工作（二）常用液体的配制 （一）缓冲溶液： 1．2．枸椽酸缓冲液（C6H5Na3O7·2H2O）3g，枸橼酸（C6H8O7·H2O）0.4g。（二）固定剂： 10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml （三）染色液 Harris苏木精液 A液： 苏木精? ?? ?? ? 1g 无水酒精? ?? ???10ml B液： 铵矾或钾矾? ?? ?20g 蒸馏水? ?? ?? ? 200ml 氧化汞? ?? ?? ? 0.5ml 冰醋酸? ?? ?? ? 8ml 将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。 ．伊红 伊红? ?? ?? ?? ?5~10g 70%~90%酒精? ?1000ml 冰醋酸??10滴 （四）其它 盐酸洒精多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。 三、水洗 固定后的组织块置水龙头下以自来水流水冲洗 24小时。冲洗好的组织可存放在75%酒精内四、脱水包埋（一）脱水 7%乙醇? ?? ?小时 8%乙醇? ?? ?小时 95%乙醇? ?? ?小时 95%乙醇? ?? ?小时 100%乙醇Ⅰ? ?小时 100%乙醇Ⅱ? ?小时 （二）透明 Ⅰ 2小时二甲苯Ⅱ 1小时 （三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法） 1．浸蜡在℃~62℃恒温蜡箱中放置个蜡杯，分别编号1（5℃~58℃）、2（℃~62℃），其中分别盛软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。 2．包埋①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。 ②准备包埋框：用金属。 ③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。 ④在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 ⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。 ⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，取出蜡块。 、石蜡切片制备（一）石蜡切片前的准备 1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。 3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（多聚赖氨酸）。 5．准备好毛笔、镊子、染色架。 6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。 （二）石蜡切片 1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。 2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。 3．调整切片机上的切片厚度为4~