串联质谱法正常人晶状体纤维蛋白质组分析研究.pdfVIP

生物技术 串联质谱法正常人晶状体纤维蛋白质组分析 张春巍刘平 哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院，哈尔滨，150001 摘要 目的：运用蛋白质组技术鉴定和分析正常人晶状体纤维的蛋白质，建立正常人晶状体纤 维的蛋白质组数据库和表达谱，为研究晶状体疾病提供基础．方法：晶状体纤维总蛋白质通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离、胶内酶切后的多肽利用液相色谱串联质谱的方法，对正常人 晶状体中的全部纤维蛋白质进行鉴定。根据高丰度离子的匹配率、匹配离子的连续性和随机 性得分，通过SEQUEST和AMASS软件筛选结果。同一样品重复做三次实验．结果：具有可 信度在98％pX上、有2个或2个以上合格谱图、不少于两次实验均鉴定的蛋白质作为阳性结果， 共60个蛋白质，有22个晶状体蛋白质在以前的晶状体蛋白质组研究中有过鉴定．结论：实验 结果为晶状体纤维的蛋白质随年龄而变化以及白内障形成机理的探索奠定基础。聚丙烯酰胺 凝胶电泳与液相色谱串联质谱相结合是简单、快捷的方法，将在大规模的临床样品研究中具 有良好的应用前景． 关键词 眼科学；蛋白质组；晶体蛋白；液相色谱串联质谱 1994年，蛋白质组的概念被正式提出‘¨。蛋白质组学‘21主张从整体水平、高通量地对蛋白质进行分析， 它是以细胞，组织内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。随着基因组草图的完成，生命科学研究进 入后基因组时代，作为生命活动的执行者和体现者——蛋白质，也随之成为研究的焦点。 近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，在对眼科疾病研究方面，蛋白质组技术也 有十分诱人的前景。眼球中的晶状体是富有弹性的无血管透明组织，晶状体干重的80％--90％是蛋白质。与 其他组织相比，其生理或病理状态均不易受外界因素影响。我们通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与液相色谱串联 质谱相结合的方法，建立了正常人晶状体纤维蛋白质数据库，为以后晶状体比较蛋白质组学的研究奠定基 础，为白内障的预防和药物治疗做有益的探索。 1材料与方法 1．1材料 (1)样品：从哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院眼库取供体死亡时间最多不超过18h的正常晶 状体12个，全部为男性，年龄35一45岁，筛选标准是没有眼手术史和眼疾病史，晶状体透明。 公司购买。其他化学试剂主要购于北京化学试剂公司。 (3)主要仪器设备：MillliQ 2100pro UV／visible FREEZER(Thermo Forma公司)， spectrophotometer为安玛西亚公司产品，超低温冰箱：．86℃ULT Deca LCQ XPH懈液质联用质谱仪(ThermoFinnigan，San 207 中国科协第四届优秀博士生学术年会论文集 II Xi 垂直板电泳仪：PROTEANCell(BioRad公司)，恒温水浴：MultiIII(安玛西亚公司)，离心浓缩仪： Temp FREEZEDRYERWITH COULTERru AvantilMj．25 centrifuge(BECKMAN公司)。 (4)分析软件：数据库搜索软件为SEQUEST整合到Bioworks(Version3．1)软件中(ThermoFinnigan 公司)。数据筛选软件：AMASS软件。(可于http：／／www．proteomics—cams，com免费下载) 1．2实验方法 (1)样品处理：新鲜晶状体完整去除囊膜之后速冻，．80C超低温冰箱保存至使用，1个月内处理完毕。 脲，409·L—CHAPS，