第4章 抗体制药 第1、2、3节.ppt

培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 洗脱液 支持物 被分离物质 被分离物的抗体 其它物质 亲合层析原理图解 一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。 为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。 目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。 免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。 7 可溶性抗原按每只小鼠10～100μg 抗原与福氏完全佐剂等量混合后注 入腹腔内，进行初次免疫，间隔 2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。 一般再采脾细胞前3日由静脉注射最 后一次抗原。刺激B细胞分裂。 脾内免疫法即在麻醉下直接将 0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。 体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。 优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。 体外免疫法：用4～8周龄BALB/c 小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO　37 C 下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。 o 2 o 二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养 细胞融合的方法： 脾细胞（1×10　） 骨髓瘤细胞（2×10　）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。 8 7 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。 PEG相对分子量4000，浓度为50% 二甲基亚砜增加融合率。 细胞融合后可产生多种融合。 　脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。 选择性培养: 培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。 三、筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 ELISA用于破伤风抗体的筛选 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是 鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。 五、单克隆抗体的大量制备 体外培养法可获的10μg/ml抗体 体内诱生法可获的5～20mg/ml抗体 用BALB/c小鼠。 降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。 第四章 抗 体 制 药 单克隆抗体技术 细胞培养技术 分子克隆 克隆技术 细胞克隆 动物克隆 重组DNA技术 蛋白质工程技术 生物传感器 组织工程技术 生物芯片技术 生物信息学技术 生物技术的范围 杂交技术 生物制药研究的几个热点领域 抗体药物研究 组合生物合成技术研究 血管抑制剂抗肿瘤药物研究 功能基因组学研究 EGF 第一节 概述 1890年Behring和北里柴三郎 发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。