1._COPD发病方法机制与主要研究方法.ppt

阻塞性肺气肿的发病机制;蛋白酶;发病机制;气道炎症;COPD: 以炎症为核心的多因素构成的疾病;氧化应激;参与COPD的蛋白酶和抗蛋白酶;COPD病理学特点;一、肺脏的变化;镜下：见肺泡壁变薄、胀大，破裂或形成大泡，血供减少，弹性纤维网破坏,气道重塑，管腔变窄。 ;气道改变;;二、肺血管、心脏改变;COPD主要研究方法;小鼠 COPD 模型建立方法;小鼠肺功能评价;小鼠血浆的收集和血细胞涂片的制备;小鼠肺组织病理学检查;H-E染色;小鼠肺组织病理学观察及形态;小鼠肺组织病理学观察及形态;免疫组化实验原理与意义?;气道粘膜石蜡切片的免疫组化;免疫组化SABC法;免疫组化问题解答 ;;;;肺组织蛋白提取;肺组织蛋白浓度测定;肺组织蛋白浓度测定;分离胶，浓缩胶配置;血浆、BALF 中细胞因子 ELISA 测定;ELISA 测定三种类型;酶联免疫分析技术(ELISA)间接法;酶联免疫分析技术(ELISA)间接法; 双抗体夹心法 ;双抗体夹心法;双抗体夹心法; 竟争法 ;竟争法操作步骤;Q-PCR实验流程;Q-PCR用途;;;Q-PCR实验流程;总RNA抽提;RNA提取-RNA质量;去基因组; 然后按以下步骤操作： 1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。 2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。 加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min； 4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清； 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干； 加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。;四、总RNA纯度和完整性检测; mRNA逆转录;microRNA逆转录;在去RNase的PCR管中配置以下溶液： 2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构； 3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液： 4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min； 5）42℃孵育50min； 6）85℃孵育10min灭活逆转录酶。;定量PCR检测;;;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳操作流程;琼脂糖凝胶电泳操作流程;琼脂糖凝胶的优点.缺点;DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理;操作步骤;3. 加样;5. 结果观察;小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察;巨噬细胞培养;血细胞形态;4、晚幼粒细胞 （1、）中性晚幼粒细胞：胞体直径10~16μm，呈圆形。胞核明显凹陷呈肾形、马蹄形、半月形，但其核凹陷程度一般不超过核假设直径的一半。核染色质粗糙，排列更紧密，核仁消失。胞浆量多，染浅红色，充满中性颗粒。 （2、）嗜酸性晚幼粒细胞：胞体直径10~16μm，胞核在中央或偏一侧，呈肾形或椭圆形。核质充满着嗜酸性颗粒，其颗粒粗大呈橘红色，大小一致，但有时见到深褐色或紫棕色颗粒。 （3、）嗜碱性晚幼粒细胞：胞体直径10~14μm。胞核固缩呈肾形，轮廓模糊。胞质内及核上含有少量、分布不匀的嗜碱性颗粒。 5、杆状核粒细胞： （1、）中性杆状核粒细胞：胞体直径10~15μm，圆形。胞核凹陷程度超过核假设直径的一半，核径最窄处大于最宽处1/3以上，形态弯曲成带状，粗细均匀，核染色质粗糙呈块状，也可见核呈“S”形、“U”形或“E”形，核两端钝圆染深紫红色。胞质充满中性颗粒。 （2、）嗜酸性杆状核粒细胞：胞体直径11~16μm，圆形。胞核与中性杆状粒细胞相似。胞质充满着粗大的橘红色嗜酸性颗粒。 （3、）嗜碱性杆状核粒细胞：胞体直径10~12μm。胞核呈模糊杆状。胞质内及胞核上含有紫黑色、大小不匀、数量较少的嗜碱性颗粒。 6、分叶核粒细胞： （1、）中性分叶核粒细胞：胞体直径10~14μm，圆形。胞核分叶状，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，或者虽未断开，但有粗而明显的切痕。核常分2~5叶，核染色质浓集或呈较多小块，染深紫红色。胞质丰富，染淡红色，浆内分布着细小紫红色中性颗粒。 （2、）嗜酸性分叶核粒细胞：胞体直径11~16μm。胞核多分为两叶。胞质充满着粗大呈橘红色嗜酸性颗粒。 （3、）嗜碱性分叶核粒细胞：胞体直径10~12μm。胞核可分3~4叶或分叶不明显，常融合呈堆集状。胞质嗜碱性颗粒呈紫黑色，大小不一，分布不均，常掩盖在核上，以致核的形态看不清，有时很难确定为哪一个阶段细胞。;正常单核细胞系统形态？ 1、原始单核细胞：胞体直径15~20μm，圆或椭圆形。胞核较大，圆形、类圆形，核染色质纤细，呈疏松网状，结构不清晰，核仁1~3个。胞质较其它原始