PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株.pdf

遗 传 学报，23(1):69-76,1996 ActaGeneticaSinica PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生 质体获得转基因植株 周冀明①② 卫志明① 许智宏① 刘世贵② 罗 鹏③ ①（中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室 上海 200032) ②（四川大学生物工程系 成都 610064) ③（四川大学生物系 成都 610064) 摘要 采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料，分离原生质体，在原生质体培养基中作液体 浅层暗培养，植板率为5%，植株再生频率为 100 。作者进而开展了遗传转化研究。为研究 PEG介导转化诸葛菜原生质体的影响因素，通过瞬间表达，实验了PEG法转化子叶原生质 体的过程，在此基础上将分离纯化后的原生质体与带HPT基因的质粒DNA(pB1222)混合， HPT基因作选择标记，PEG介导转化；重新收集转化后的原生质体，以5x104/ml的密度．在 原生质体培养基中作浅层培养；培养10-15天后用25mg/L的潮霉素h（ygromycin)进行筛 选，一月后出现少量细胞团，转人含潮霉素50mg/L的扩增培养基扩增愈伤组织，进而替人 含50--100mg/L潮霉素的分化培养基诱导分化成苗，分化率为1,00%，转人生根培养基中 生根成完整植株。抗性植株再生率为4x10-s。在获得再生转基因植株后，以再生植株叶片 为材料，进行Southernblot分子杂交，证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达，再 生转基因植株频率为10-1。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。 关键词 诸葛菜，下胚轴，原生质体培养，PEG法，转基因植株 诸葛菜 O（rychophragmusviolaceus）为十字花科诸葛菜属，主要分布于我国及朝鲜， 是一种观赏花卉植物，同时也是蔬菜和油料植物。近年来，由于发现其种子油的芥酸、亚 麻酸含量低，亚油酸和棕桐酸含量高，是极为理想的优质食用油，因而有关诸葛菜生物特 性的研究越来越引起人们的重视1,［21。目前在诸葛菜属中原生质体培养方面仅有两篇报 道11，310 采用基因工程方法改良作物是世界上普遍关注的课题，建立有效的外源基因转移系 统是植物基因工程的一个至关重要的方面。PEG法最早用于植物原生质体融合研究， 1982年Kren首次用于转化研究，其作用是在二价阳离子存在下促进原生质体对外源 DNA的吸收，同时还保护外源DNA免受核酸酶的降解181。近年来，转基因植物研究发 展迅速，迄今获得转基因植株的植物已有50多种，分属21科，其中PEG法占5.3%。而 在诸葛菜属植物中至今未见有关遗传转化方面的报道[11，本文报道了诸葛菜下胚轴原生 质体培养再生植株，并在此基础上采用PEG法介导转化下胚轴原生质体获得转基因植 本文于1994年5月31日收到。国家自然科学基金资助课题 70 遗 传 学 报 23卷 株，填补了遗传转化研究工作中的一项空白。 1 材料和方法 1.1下胚轴原生质体分离[3)［ 将下胚轴切成0.5mm左右小段，纵剖，移到CPW--13M 中质壁分离 1小时，转入酶 液中于25-28℃往复式摇床 4（5转／分钟）上酶解12小时。200目尼龙网过滤，500rpm 离心5分钟，收集原生质体。CPW-9M 同样条件下洗两次，沉下的原生质体重新悬浮于 2mlCPW-9M中。在lOml离心管中加人8mlCPW--21S溶液，再在此液面上缓缓加 人上述2ml原生质体悬浮液，离心5分钟 6（00转 ／分钟），小心吸出漂浮于溶液界面间的 原生质体，重新用CPW-9M离心洗涤一次，最后用原生质体培养基离心洗涤一次，即得 到纯净的原生质体。 1.2原生质体培养方法13［1 纯化后的原生质体悬浮于原生质体培养基中，密度调节为5x104/ml，取2m1接种 在直径为6cm的培养皿中，置于28℃下暗培养，待长成细胞团后转人弱光 3（00-5001x) 下培养，每天12小时弱光12小时黑暗交替。原生质体再生长成直径0.5mm的小愈伤组 织后，转人扩增培养基培养。待愈伤组织长大至直径1.5-2mm时，转入分化培养基中诱 导分化成苗。当分化出