成年体细胞克隆的绵羊.pdf

第十二届全圈动物繁殖学肃讨论会论文囊 成年体细胞克隆的绵羊。 苟克勉安晓荣关宏侯健陈永福 中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京 100094 SOF溶液培养7天后．结果颗粒细胞组的囊胚率(26．9％)显著(p0．05)高于耳朵细胞组(158％)。 48枚克隆囊胚用OPS玻璃化方法冷冻15个月后，移植给同期化的受体，5倒妊娠，其中潦于颗粒细胞 只一直健康成活，是我国克隆成功的首例绵羊。本文结果表明，克隆胚胎能够耐受长期的冷冻过程。 关键词：体细胞核移植玻璃化胚胎移植克隆羔羊 一 细胞克隆的胚胎，冷冻15个月后，不仅获得了健 从1997绵羊Dolly出生以来。国际上已经有 10种哺乳动物克隆成功[1-”】．我国只有山康成活的我国首例克隆绵羊，而且也证实，长期 冷冻的克隆胚胎能够有效地生产健康动物。 羊|【11；12】、牛(t3；14j两种克隆动物出生。已知的大 多数克隆动物均源于新鲜的克隆胚胎。纵观整 1．材料和方法 个动物胚胎生物技术领域。作为一项非常有效的 1．1．核移植 动物生物技术．胚胎冷冻是体外受精等技术体 主要药品购自Stgma公司。依照以前文献 系，特别是实用技术体系的重要组成部分。遗憾 所述㈣17；”】，进行细胞培养和核移植操作。具 的是，我们还不能肯定克隆胚胎抗冷冻的能力， 体的讲，1只美利奴绵羊的颗粒细胞(M一002) 因此无法将两者有机的结合起来，形成一个强有 力的技术体系。文献检索发现，短期冷冻后，日 胞，体，l-tg养数代后，分别用于核移植。其中M 本黑牛肌肉细胞融合得到的克隆胚胎【l“、奶牛 一002细胞传代4次，0。5％FBS饲养4d；PD一 皮肤成纤维细胞徒手切割方法生产的克隆囊 3和PD一5细胞传代2次。饥饿24h。 胚[16】均能发育成健康的克隆动物，这些克隆胚 屠宰场来源的卵母细胞采集、体外成熟参见 h． 文献所述【tT-z0]。具体而言。IVM后20一22 胎的冷冻时间只有l一2个月(Tecidioglu．个人 通讯)．实际应用价值不大。我们课题组曾经移 进行显微操作，操作液为无Ca2+和M92+的 植过冷冻5个月的牛[13】和绵羊[171的克隆囊胚， 并且由此获得了3例全程妊娠受体。共产出4头 溶液中完成，用H33342染液检测去核完整与 克隆动物。遗憾的是，它们均在产后1h左右死 否。显微操作完成后．IVM后23—25h间，进行 亡[13舯]。至今．我们无法知道长时间冷冻对克融合。融合后l mM 隆胚胎的潜在影响力。本实验利用成年绵羊体 5min．然后在2 6一DMAP溶液中培养2h。 一143— 第-t-二届全国动物繁殖学术讨论av{g-文集 1．2胚胎培养和冷冻 ％sucrose溶液中5min，洗涤数次，直接移植至 旺胎培养使用4一孔培养盘(Nunc)，培养体用CIDR同期化的小尾寒羊子宫角．每只羊移植 2枚克隆囊胚。第60天时检测受孕情况．第147 系为6009L的SOF溶液，覆盖300}tL石蜡油。 天时进行剖腹产手术。 培养条件为5％0晚，5％02和90％N2的气 体环境，温度为385。C，分别在第2和7天统计1．4．统计分析 胚胎发育情况。