贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立.pdfVIP

第 31卷 第 3期 渔 业 科 学 进 展 Vo1．31，NO．3 2 O 1 O 年 6月 PROGRESSIN FISHERY SCIENCES Jun．，2010 贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重 荧光定量 PCR方法的建立 谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤 (广西兽医研究所 ，南宁 530001) 摘 要 根据 GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基 因序列，用PrimerExpress2．0软件设计 了 两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化 ，建立 了能够 同时检测单孢子 虫和 折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子 虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到 4O 个模板拷贝数 ；此外抗干扰能力强，对单孢子虫和折光马尔太虫不 同模板浓度进行组合，仍可有效地 同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞茵、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧茵和拟态孤菌 等病原体的检测，结果全为阴性 。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量 PCR具有特异、敏 感、快速、定量、重复性好等优点，可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。 关键词 单孢子虫 折光马尔太虫 二重荧光定量PCR 中图分类号 $944．3，Q78 文献识别码 A 文章编号 1000—7075(2010)03—0077-07 Developmentofduplexreal—timePCR assayfordetection of Haplosporidium sp．andMarteiliarefringensinshellfish XIELi-ji XIEZhi—xun PANGYao—shan LIUJia—bo DENG Xian——wen XIE Zhi——qin (GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001) ABSTRACT Twosetsofspecificoligonuc1eotideprimersforHaplosporidium sp．andMar— teiliarefringens，alongwithtwoTaqManprobesspecificforeachprotozoanparasitewerede— signedwithPrimerExpress2．0software．Thereactionparameterssuchastheconcentrationof twopairofprimers，twoTaqM anprobesandthereactionbufferwereoptimizedtOdevelopdu— plexreal—timePCRassayfortherapiddetectionofHaplosporidium sp．andMarteiliarefrin— gens．Thesensitivityofduplexreal—timePCRassaywas40templatecopiesforHaplosporidium sp．andMarteiliarefringens．Theduplexreal—timePCRassaywasfoundtobespecificandto beabletodetectanddifferentiateHaplosporidiurnsp．andMarteiliarefringens，andnoposi— tiveresultswereobservedwhennucleicacidfromPerkinsussp．，Pseudornonasfluorescens，Vib— rioparahaemolyticu，V．Alginolyticu，V．FluvialisandV．M imicuswereusedasduplexreal— timePCR templates．Thisduplexreal—timePCR assayi