重组活性羧肽酶B的克隆表达及复性研讨.pdfVIP

重组活性羧肽酶 B 的克隆表达及复性研究 1,2 2 1 2 1 李素霞 张育坚 夏文超 龚毅 袁勤生 1 华东理工大学生物反应器国家重点实验室 上海200237 2 中国科学院上海生命科学研究院生物工程中心 上海200233 前言 羧肽酶B carboxypeptidase B, CPB EC 是一种含锌的胰外肽酶 特异的水解肽链C 端的碱性氨基酸 精氨酸 赖氨酸或鸟氨酸 CPB 含307 个 氨基酸 分子质量 35ku 天然存在的 CPB 是由前羧肽酶原 B preprocarboxypeptidase B 产生的 其N-末端包含108 个氨基酸 其中13 个 氨基酸为信号肽序列 95 个氨基酸组成活性肽部分 的片段与C 端的CPB 相连 前羧肽酶原 B 在转运到内质网的过程中 信号肽被切掉 得到不具酶活性羧肽 酶原 B procarboxypeptiedase B, pCPB 从细胞中分泌出来 然后通过胰蛋白 酶将其酶解为具酶活性的CPB 和活性肽部分 由于CPB 是一种蛋白水解酶 在 体内以酶原形式分泌 直接表达 CPB 可能会对表达系统产生影响 故考虑用酶 原的形式表达 表达出的pCPB 再进行胰蛋白酶酶切获得具酶活性的CPB 目前 商业及研究中使用的 CPB 均为从动物胰腺提取 价格昂贵 而且并 不能完全去除其他蛋白酶 对于羧肽酶的克隆 表达仅有一篇文献报道[130] 但 没有对重组羧肽酶B 应用方面的报道 本研究用羧肽酶原B 基因克隆表达酶原 再进行蛋白酶切的方法得到CPB 该方法简单可行 表达量高 经DEAE-FF 一 步纯化后 每升可得28.5 mg 的重组CPB, 与生物提取相比 具有价廉 无污染 的特点 1 材料 质粒: pMD- 18T, Takara; pT7-473-pCPB; 表达载体pT7-473, 克隆菌株DH5 , 表达菌株 BL21(DE3), 由中科院上海生物工程中心龚毅组保存 猪羧肽酶 B 176u/mg protein , 马尿酰 L 精氨酸为底物测定 Sigma ; 马尿酰 L 赖 氨酸 Sigma; 胰蛋白酶 250NF.U/mg , Amresco BBST 分装 限制性内切酶 Nde I, Hind III, 及ligation kit, Takara Rneasy Minikit, Qiaogen; ThermoscriptTM RT-PCR system, Invitrogen; Ni-NTA, DEAE sepharoseTM fast flow, Amersham Pharmacia Biotech AB; Glutathione oxidized and reduced, Amresco 分装 2 方法 2.1 pCPB 基因的获得 大鼠脱颈致死 立即打开腹腔 取出胰脏 切割约0.1g 液氮中研磨 收集 研磨粉末约30mg 匀浆 用Rneasy Minikit 抽提总RNA 以总RNA 为模板进 行反转录随机引物反转录得 cDNA 取 2 l 做模板 设计的特异引物 pCPB-s1/pCPB-s2 和pCPB-a 做PCR PCPB s2: 5’ — GCG GGA TCC CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC3’ (含BamH I 酶切位点和编码N 端9 个 proCPB 的氨基酸) pCPB a 5’ — CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATA ATT — 3’